Financiado por FONDECYT 1010992.

INTRODUCCIÓN

Aunque han existido importantes avances en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca crónica (ICC), su morbimortalidad continúa siendo elevada¹. Diversos estudios han demostrado un aumento del estrés oxidativo en pacientes con ICC. La isquemia-reperfusión, mayor actividad neurohumoral, estimulación por citocinas y la presencia de células inflamatorias son estímulos generadores de radicales libres y modificadores del estado de estrés oxidativo en la ICC^2-5. Estudios básicos y clínicos sugieren que los radicales libres del oxígeno podrían contribuir al deterioro de la función cardíaca^2-7. Los radicales libres incluyen los aniones superóxido, radicales hidroxilo, peróxido y H₂O₂⁸. Estos son productos del metabolismo y se mantienen en bajas concentraciones mediante la acción de diversos sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. En condiciones normales existe un balance entre la producción de los radicales libres del oxígeno y los sistemas defensivos antioxidantes. Cualquier alteración en este balance a favor de los radicales libres produce estrés oxidativo.

Experimentos en ratas con infarto agudo de miocardio han sugerido una estrecha relación entre la aparición de insuficiencia cardíaca y estrés oxidativo³. Estudios in vitro han revelado que breves exposiciones a radicales libres resultan en disminución de fosfatos de alta energía, pérdida de función contráctil y anormalidades estructurales⁹. Se han demostrado concentraciones elevadas de pentano en el aire espirado y un aumento en los valores plasmáticos de malondialdehído (MDA), un marcador indirecto de peroxidación lipídica, en pacientes con ICC^10-12. Además, altas concentraciones de MDA en el plasma se correlacionan con una mayor gravedad de los síntomas y compromiso funcional de la ICC¹³.

Se han utilizado diferentes intervenciones terapéuticas para disminuir el estrés oxidativo en pacientes con ICC. A nivel experimental, utilizando modelos de isquemia y reperfusión, se ha demostrado que la administración de antioxidantes previene o retrasa la transición desde un estado de insuficiencia cardíaca compensada hacia uno de descompensación¹⁴. A nivel clínico, la terapia crónica con bloqueadores beta en pacientes con ICC disminuye el estrés oxidativo¹⁵. El trasplante cardíaco es una alternativa terapéutica consolidada en pacientes con ICC y grave limitación funcional¹⁶. Teóricamente, el trasplante cardíaco podría disminuir el estrés oxidativo al mejorar la función cardíaca. Sin embargo, estudios realizados en animales han demostrado un mayor metabolismo de radicales libres del oxígeno con un consiguiente aumento del estrés oxidativo^17-19. Pocos estudios clínicos han evaluado el estado del estrés oxidativo postrasplante cardíaco, y algunos autores lo han relacionado con la presencia de infección, rechazo o uso de fármacos inmunosupresores^20-22. Recientemente, un aumento del estrés oxidativo se ha atribuido a una disminución de la capacidad enzimática antioxidante después del primer año del trasplante²³.

El objetivo de este trabajo fue estudiar el estado de estrés oxidativo postrasplante cardíaco utilizando mediciones plasmáticas de MDA y de la actividad de los diferentes sistemas antioxidantes enzimáticos. Las mediciones obtenidas se comparan con la realizada en pacientes con ICC y con las de un grupo de sujetos sanos.

PACIENTES Y MÉTODO

Pacientes con trasplante cardíaco

En este estudio se incluyó a 11 pacientes con trasplante cardíaco (8 varones), con una edad promedio de 48 años (rango, 16-62 años). El tiempo promedio postrasplante fue de 20 meses (rango, 12-26 meses). El protocolo de inmunosupresión consistió en ciclosporina A, azatioprina y esteroides. En todos los pacientes se realizaron biopsias endomiocárdicas dentro de 2 semanas de la medición de los parámetros de estrés oxidativo. Las biopsias se efectuaron por punción yugular según la técnica clásica y biótomos desechables, en los cuales se obtiene al menos 4 muestras para diagnóstico microscópico. Las biopsias se analizaron siguiendo la clasificación del Grupo de Estudio del Rechazo Cardíaco de la Sociedad Internacional de Trasplante de Corazón y Pulmón²⁴. Ningún paciente tenía evidencia de rechazo cardíaco en las biopsias efectuadas ni evidencias de infección en un período de 3 meses como mínimo. El ecocardiograma de todos los pacientes mostraba una fracción de eyección normal y se encontraban en capacidad funcional (CF) I de la NYHA.

Pacientes con insuficiencia cardíaca

Se estudió a 19 pacientes con insuficiencia cardíaca, todos varones, con una edad promedio de 61 años (rango, 44-75), en CF III, estables y en tratamiento habitual (diuréticos, digital, inhibidores de la enzima conversiva de la angiotensina [IECA] y sin bloqueadores beta al momento del estudio). Todos los pacientes tenían dilatación y disfunción sistólica con fracción de eyección (FE) determinada por ecocardiograma < 40%. La etiología fue isquémica en 7 pacientes (37%), miocardiopatía dilatada idiopática en siete (37%) e hipertensiva en 5 pacientes (26%). Se excluyó a pacientes con: a) CF IV, shock cardiogénico; b) cirugía de bypass coronario, angioplastia o infarto de miocardio en los últimos 3 meses; c) angina crónica; d) cambio en el tratamiento o uso de bloqueadores beta en los últimos 2 meses; e) enfermedad valvular significativa; f) presencia de factores descompensantes como síndrome coronario agudo, disfunción valvular, arritmia, infección, anemia grave, hipertiroidismo o embolia pulmonar, y g) presencia de condiciones que pudieran afectar las determinaciones de estrés oxidativo como insuficiencia renal (creatinina plasmática > 2 mg/dl), enfermedades autoinmunes, neoplasia, enfermedad pulmonar o hepática avanzada, inflamación aguda o crónica.

Controles sanos

Por motivos éticos no se pudo contar con un grupo control que recibiera tratamiento con fármacos inmunosupresores. El grupo control estuvo conformado por 14 sujetos sanos pareados por edad y sexo. Todos ellos eran asintomáticos, sin antecedentes mórbidos de importancia y examen físico normal. Se excluyó a sujetos con factores de riesgo coronario conocidos, o si estaban en tratamiento con cualquier medicación, suplementos vitamínicos, antioxidantes, o ingerían alcohol de forma regular.

Todos los sujetos firmaron un consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética del Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

Marcadores de estrés oxidativo

Los parámetros de estrés oxidativo se determinaron en sangre periférica. En los 3 grupos se midieron las actividades enzimáticas de superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GSH-Px) y los valores plasmáticos del MDA, para lo cual se obtuvo 20 ml de sangre por punción venosa periférica. La muestra se centrifugó a 3.000 rpm por 10 min a temperatura de 4 ºC. El plasma se separó y almacenó a ­20 ºC. Los eritrocitos se lavaron 3 veces con solución salina y fueron posteriormente lisados y almacenados a ­20 ºC.

MDA

Se determinó en el plasma midiendo el contenido de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS)²⁵. Sus valores se expresaron como μ M.

SOD

Se extrajo el hemolizado utilizando el método descrito por Mc Cord et al²⁶. Para la medición de actividad se usó el método de Misra et al²⁷. Éste se basa en la determinación de la velocidad de autooxidación de epinefrina, la que es acelerada por SOD. El grado de oxidación se determinó por fotocolorimetría a 480 nm. La actividad se expresó como unidades (U) por mg hemoglobina (Hb).

CAT

Se determinó por el método descrito por Beers et al²⁸. La reacción se inició por adición de 1 ml de 30 mM H₂O₂. El cambio en absorbancia a 240 nm se midió por 1 min a 25 ºC. En una parte de la muestra remanente se determinó la hemoglobina y la actividad se expresó como U (nm de H₂O₂/min) por g Hb.

GSH-Px

Se determinó con el método descrito por Paglia et al²⁹ y se expresó como U (nm NADPH oxidado/min) por g Hb.

Análisis estadístico

Se utilizó el test de la t de Student para muestras no pareadas, y se consideró como significativo un valor de p < 0,05. Los valores se presentan como la media ± desviación estándar (DE).

RESULTADOS

La tabla 1 muestra las características clínicas de los pacientes trasplantados y de los pacientes con insuficiencia cardíaca. No hubo diferencias significativas en edad. Del grupo con ICC, cinco eran hipertensos, tres diabéticos, cuatro dislipidémicos y seis habían sufrido IAM. Trece pacientes utilizaban IECA (68%), 16 diuréticos (84%), y 14 digitálicos (74%). Ningún paciente era fumador en el momento del estudio. La FE fue de 33% en el grupo con ICC y de 60% en los trasplantados.

En la figura 1 se muestran los resultados de las determinaciones de MDA plasmático. Los valores de MDA se encontraron significativamente aumentados en los pacientes con ICC y trasplante cardíaco respecto del grupo control (3,27 ± 1,7; 3,35 ± 0,8, y 0,9 ± 0,3 μ M, respectivamente), sin existir diferencias significativas entre pacientes trasplantados y con ICC. Las figuras 2-4 muestran los resultados de la medición de las actividades plasmáticas de los sistemas antioxidantes SOD, CAT y GSH-Px, respectivamente. La actividad de SOD en el grupo trasplantado fue inferior respecto a los grupos ICC y control (0,44 ± 0,1 frente a 0,87 ± 0,6; 1,3 ± 0,4 U/mg Hb, respectivamente; p < 0,05). No hubo diferencias significativas en la actividad de CAT entre los grupos de ICC y trasplantados (187 ± 67 y 162 ± 31 U/mg Hb, respectivamente), aunque fue menor en trasplantados respecto al grupo control (193 ± 29 U/mg Hb; p < 0,05). Por otra parte, la actividad de GSH-Px fue superior en el grupo trasplantado respecto del grupo control (0,40 ± 0,07 y 0,33 ± 0,05 U/g Hb; p < 0,05), mientras que no hubo diferencias significativas entre los grupos ICC y control.

Fig.1. Valores plasmáticos de malondialdehído (MDA) en sujetos controles (n = 14) y pacientes con ICC (n = 19) y trasplante cardíaco (n = 11). Los valores corresponden al promedio ± desviación estándar. *p < 0,05 frente a control.

Fig. 2. Actividad plasmática de superóxido dismutasa (SOD) en sujetos controles (n = 14) y pacientes con ICC (n = 19) y trasplante cardíaco (n = 11). Los valores corresponden al promedio ± desviación estándar. *p < 0,05 y **p < 0,05 frente a control e ICC, respectivamente.

Fig. 3. Actividad plasmática de catalasa (CAT) en sujetos controles (n = 14) y pacientes con ICC (n = 19) y trasplante cardíaco (n = 11). Los valores corresponden al promedio ± desviación estándar. *p < 0,05 frente a control.

Fig. 4. Actividad plasmática de glutatión peroxidasa (GSH-Px) en sujetos controles (n = 14) y pacientes con ICC (n = 19) y trasplante cardíaco (n = 11). Los valores corresponden al promedio ± desviación estándar. *p < 0,05 frente a control.

DISCUSIÓN

El principal hallazgo de este estudio es que pacientes sometidos a trasplante cardíaco tienen un aumento del estrés oxidativo, evidenciado por una elevación en la concentración plasmática de MDA. Este aumento del estrés oxidativo es similar al encontrado en pacientes con ICC estable CF III de la NYHA y se observó en ausencia de episodios reconocidos de infección o rechazo.

La actividad de SOD se encuentra disminuida en los pacientes trasplantados respecto del grupo control, mientras que la actividad de GSH-Px se encontró aumentada postrasplante cardíaco respecto al grupo control. Por otro lado, no se observaron cambios significativos en la actividad de la CAT entre el grupo de los ICC y los trasplantados. Estos resultados muestran que existe un cambio en las actividades de los sistemas antioxidantes enzimáticos en pacientes con ICC y trasplantados, que en forma global lleva a un aumento en el estrés oxidativo.

La lipoperoxidación de las membranas es un proceso relativamente lento. Sin embargo, ciclos de isquemia reperfusión recurrentes en el corazón y en el músculo esquelético y la autooxidación de las catecolaminas pueden aumentar la lipoperoxidación de las membranas. El resultante aumento del estrés oxidativo favorecería la transición hacia un estado caracterizado por depresión de la función cardíaca. Este aumento del estrés oxidativo se ha demostrado en pacientes con IC a través de una elevación en los valores plasmáticos de MDA³⁰. Un aumento del estrés oxidativo postrasplante cardíaco ha sido descrito en animales que presentan rechazo cardíaco agudo¹⁷. Chancerelle et al³¹ observaron valores aumentados de MDA en pacientes trasplantados sin evidencia de rechazo y esta peroxidación lipídica aumentada ha sido descrita como uno de los mecanismos responsables de aterogénesis acelerada postrasplante³². Recientemente, Schimke et al²³ evaluaron e l estrés oxidativo en biopsias de tejido miocárdico en distintos períodos postrasplante cardíaco en pacientes sin rechazo agudo. Ellos observaron un aumento del MDA en los tres primeros meses postrasplante, una caída y un posterior incremento luego del primer año. El aumento en el estrés oxidativo en el primer período se atribuyó al procedimiento mismo del trasplante (isquemia del corazón donante, tiempo isquémico y reperfusión, infecciones virales o bacterianas)^33-35. Los cambios en las membranas (lipoperoxidación) debido a un elevado estrés oxidativo pueden ser parcialmente responsables para esas manifestaciones de la enfermedad.

Basados en estudios en animales, Kirshenbaum y Singal³⁶ postularon que cuando se produce un aumento en la generación de radicales libres del oxígeno, los corazones en una respuesta adaptativa aumentan los sistemas de defensas enzimáticos. Así, el estrés oxidativo puede ser prevenido o minimizado. Sin embargo, esta respuesta adaptativa es limitada, produciéndose en etapas más avanzadas, como por ejemplo en la ICC, un déficit en los sistemas antioxidantes enzimáticos³⁷. Se ha reportado que la hipertrofia cardíaca en ratas y cobayas está asociada a una disminución del estado de estrés oxidativo y a un aumento en la reserva antioxidante^11,12, mientras que la ICC bajo condiciones agudas y crónicas está asociada a un aumento del estado de estrés oxidativo y a una reducida reserva antioxidante^3,7. Estos hechos son bastante interesantes, pues se ha sugerido que SOD y GSH-Px son los más importantes en la detoxificación de los metabolitos de las especies reactivas en el corazón³⁸. El SOD es la primera línea de defensa contra el daño mediado por radicales libres, y actúa aumentando los valores de H₂O₂. El principal daño en la acumulación de H₂O₂ es la producción de la especie altamente reactiva radical hidroxilo, para la cual no existen sistemas fisiológicos de defensa, como resultado de esto, la CAT y GSH-Px llegan a ser las enzimas antioxidantes más cruciales en estos grupos de pacientes con baja actividad de SOD. Adicionalmente, un agotamiento en la actividad de los sistemas antioxidantes enzimáticos se puede producir por daño directo por radicales libres, puesto que se ha demostrado que H₂O₂ inactiva al SOD³⁹, y valores plasmáticos disminuidos de SOD se han encontrado en ratas postrasplante car díaco¹⁸.

En el estudio de Schimke et al se demostró un aumento de las actividades de GSH-Px y SOD postrasplante. Sin embargo, después del primer año, la actividad de SOD tiende a caer, lo que coincide con el incremento del estrés oxidativo²³. En el presente estudio, junto con el aumento de las concentraciones plasmáticas de MDA, encontramos una elevación en la actividad de GSH-Px; sin embargo, la actividad de SOD estaba reducida, lo que se traduciría en una respuesta adaptativa insuficiente. Este estado de estrés oxidativo aumentado se ha demostrado en pacientes con IC a través de una elevación en los valores plasmáticos de MDA³². En una serie de pacientes con ICC refractaria, además de valores aumentados de MDA, nosotros demostramos una caída en la actividad de la GSH-Px (presentado en el XXII Congreso Anual de la Sociedad Europea de Cardiología, Amsterdam. Agosto 2000).

Dado que la CAT tiene más baja afinidad por H₂O₂, se ha postulado que el sistema GSH-PX es la principal ruta metabólica del H₂O₂ en el corazón. Sin embargo, la CAT permite a la célula descomponer H₂O₂ independiente de la concentración intracelular de glutatión, puesto que se ha demostrado que el contenido de tioles plasmáticos, un índice del estado oxidativo del medio extracelular, está reducido en pacientes con ICC⁴⁰. Por otro lado, Dieterich et al⁴¹ encontraron un aumento en la expresión de CAT en el corazón de pacientes con ICC en etapa final, considerándose que esta inducción es una respuesta compensatoria del corazón frente al elevado estrés oxidativo de estos pacientes, mientras que la actividad de la SOD y la GSH permaneció inalterada.

Limitaciones del estudio

Entre las limitaciones de nuestro estudio se cuenta el reducido número de pacientes objeto de estudio. Se trata de un estudio comparativo y no de seguimiento, por lo cual no existe demostración de los cambios atribuidos al trasplante cardíaco. No se evaluó el estrés oxidativo en el miocardio, sino en el plasma, con las limitaciones de extrapolar estos resultados a lo que sucede en el miocardio o reflejar lo que ocurre en otros órganos; aunque la sangre puede ser un reflejo de la capacidad de todo el organismo frente a condiciones de estrés oxidativo, y sus valores y actividades enzimáticas podrían expresar múltiples fuentes de estrés oxidativo, entre ellas el músculo estriado en insuficiencia cardíaca.

CONCLUSIÓN

Existe un estado de estrés oxidativo aumentado postrasplante cardíaco comparable al de sujetos con ICC estable CF III. Adicionalmente, se observa un aumento en la actividad antioxidante de GSH-Px con una importante caída en las actividades de SOD.

Correspondencia: Dr. P. Castro.
Departamento de Enfermedades Cardiovasculares.
Hospital Clínico. Pontificia Universidad Católica.
Marcoleta, 347. Santiago. Chile.
Correo electrónico: pcastro@med.puc.cl

Bibliografía