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Comparación cuantitativa ex vivo e in vivo de las dimensiones del lumen medidas por tomografía de coherencia óptica y ecografía intravascular en arterias coronarias humanas

Nieves Gonzalo^a; Patrick W Serruys^a; Héctor M García-García^a; Gijs van Soest^a; Takayuki Okamura^a; Jurgen Ligthart^a; Michiel Knaapen^b; Stefan Verheye^c; Nico Bruining^a; Evelyn Regar^a

a Department of Cardiology. Thoraxcenter, Erasmus MC. Rotterdam. Países Bajos.
b Histogenex. Antwerp. Bélgica.
c Antwerp Cardiovascular Institute Middelheim Hospital. Antwerp. Bélgica.

Rev Esp Cardiol. 2009;62:615-24.

Introducción y objetivos. La relación entre las dimensiones del lumen medidas por ecografía intravascular (IVUS) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en arterias coronarias humanas no es bien conocida. Los objetivos son comparar las dimensiones del lumen en IVUS, OCT e histología en arterias coronarias humanas ex vivo, y comparar in vivo las dimensiones del lumen obtenidas en pacientes con IVUS, OCT con oclusión y OCT sin oclusión. Métodos. Estudio ex vivo: el área luminal se midió en secciones anatómicas correspondientes en IVUS, OCT e histología en arterias coronarias humanas. Estudio in vivo: el área luminal se midió en regiones correspondientes en IVUS y OCT con y sin oclusión. Resultados. Ex vivo: en las 8 muestras estudiadas, el área del lumen fue más grande en IVUS y OCT que en histología ¿diferencia media, 0,8 ± 1 mm2 (28%) para OCT y 1,3 ± 1,1 mm2 (40%) para IVUS¿. In vivo: en los cinco vasos analizados las dimensiones del lumen fueron más grandes en IVUS que en OCT ¿diferencia área media del lumen, 1,67 ± 0.54 mm2 (33,7%) para IVUS y OCT con oclusión y 1,11 ± 0.53 mm2 (21,5%) para IVUS y OCT sin oclusión¿. Las dimensiones del lumen fueron más grandes en OCT sin oclusión que en OCT con oclusión ¿diferencia media, 0,61 ± 0,23 mm2 (13%). Conclusiones. En arterias coronarias humanas fijadas, IVUS y OCT sobrestimaron el área del lumen en comparación con la histología. In vivo, las dimensiones del lumen fueron más grandes en IVUS que en OCT con o sin oclusión. La técnica de adquisición de OCT (con o sin oclusión) influye en las dimensiones del lumen.

Palabras clave: Tomografía de coherencia óptica. IVUS. Dimensiones del lumen. Ex vivo. In vivo. Imagen intracoronaria.

INTRODUCCIÓN

La tomografía de coherencia óptica (OCT) es un nuevo método de diagnóstico intracoronario que proporciona imágenes de alta resolución de la arteria coronaria in vivo ¹. La técnica, por lo general, es análoga a la ecografía intravascular (IVUS), pero en lugar de las ondas de radiofrecuencia empleadas en IVUS, la OCT utiliza luz. En ambas modalidades de imagen, la sonda se retira automáticamente a través del segmento coronario en estudio. A diferencia del IVUS, la OCT requiere desplazar la sangre del vaso durante la captura de imágenes. Esto es necesario porque los hematíes son un medio no transparente que produce múltiples reflejos de la luz y atenúa significativamente la señal. Con los primeros sistemas de OCT disponibles comercialmente, la sangre se desplazaba ocluyendo proximalmente el vaso con un balón inflado a baja presión e inyectando distalmente suero durante la retirada de la sonda (técnica oclusiva)². Sin embargo, recientemente el incremento en la velocidad de la retirada (de 1 mm/s a 3 mm/s) ha permitido el desarrollo de la técnica no oclusiva en la que el pullback (retirada) de OCT se realiza mientras se desplaza la sangre con inyección continua de contraste a través del catéter guía sin necesidad de ocluir el vaso³. Hasta el momento no se ha publicado qué impacto tienen estas dos técnicas de adquisición en las medidas del lumen obtenidas con OCT.

Los objetivos del presente estudio son comparar las dimensiones del lumen en IVUS, OCT e histología en arterias coronarias humanas ex vivo y comparar in vivo las dimensiones del lumen obtenidas con IVUS, OCT con oclusión y OCT sin oclusión.

MÉTODOS

Arterias coronarias humanas ex vivo

Muestras

Dentro de las 24 h post mórtem, 10 arterias coronarias descendente anterior (DA) fueron seccionadas a 1 cm de la bifurcación con la circunfleja (CX) y fijadas en formaldehído al 4%. Introductores coronarios de 6 Fr (Arrow, Reading, Pennsilvanya, Estados Unidos) se colocaron y fijaron en los bordes proximal y distal de las arterias.

Imagen intracoronaria

Para la adquisición de las imágenes intracoronarias, se sumergieron las muestras en un baño de solución salina (SS) a temperatura ambiente y se perfundieron con SS a presión fisiológica. Las imágenes de IVUS fueron adquiridas utilizando el catéter Atlantis^TM 40 MHz con un pullback motorizado a una velocidad constante de 0,5 mm/s, y las de OCT, utilizando el sistema disponible comercialmente y la sonda de 0,019" ImageWire^TM (LightLab Imaging, Westford, Massachusetts, Estados Unidos) con un pullback automático a 1 mm/s. Las mediciones del lumen para ambas técnicas (IVUS y OCT) se realizaron con el mismo software para análisis cuantitativo (CURAD BV, Wijk bij Duurstede, Países Bajos)^4-6.

Preparación y análisis histológico

Después de los procedimientos de imagen intracoronaria, las muestras se seccionaron para análisis histológico. La primera sección histológica se obtuvo en la porción distal de la bifurcación de la DA y la CX. Desde ese punto hacia proximal y distal se obtuvieron nuevas secciones a intervalos de 5 mm hasta el final de la muestra⁷.

Identificación de segmentos correspondientes

Los segmentos correspondientes en los pullbacks de IVUS y OCT se localizaron utilizando el software (CURAD BV), que es capaz de sincronizar imágenes adquiridas con diferentes técnicas en una sola pantalla. Los introductores proximal y distal se emplearon como marcas longitudinales. Las secciones histológicas se utilizaron para identificar la correspondiente localización en el pullback de OCT basándose en una morfología del lumen similar. Posteriormente, la sincronización de los pullbacks de IVUS y OCT en el software identificó la correspondiente imagen en IVUS⁸ (fig. 1). Sólo fueron seleccionadas imágenes en las que el catéter de IVUS pudiera moverse libremente en el lumen, para evitar el efecto Dotter.

Fig. 1. Selección de imágenes correspondientes en ecografía intravascular (IVUS), tomografía de coherencia óptica (OCT) e histología ex vivo. La primera sección histológica se obtuvo de la porción distal de la bifurcación de la descendente anterior (DA) y la circunfleja (CX) (*). Desde ese punto hacia proximal y distal nuevas secciones fueron adquiridas a intervalos de 5 mm hasta el final de la muestra (A). Las secciones histológicas (B) se utilizaron para identificar la localización correspondiente en el pullback de OCT (C) basándose en una morfología similar del lumen. Posteriormente, la sincronización de los pullbacks de IVUS y OCT en el software de visualización (CURAD BV, Wijk bij Duurstede, Países Bajos) permitió la identificación de la imagen correspondiente en IVUS (D).

Arterias coronarias humanas in vivo

Población de estudio

Se incluyó a pacientes en los que se realizó OCT en una arteria coronaria. El comité ético del Erasmus MC aprobó el estudio y todos los pacientes dieron su consentimiento informado.

Adquisición y análisis de IVUS

Las imágenes de IVUS fueron adquiridas después de la administración intracoronaria de nitroglicerina utilizando el catéter Eagle Eye 20 MHz (Volcano Corp., Rancho Cordova, Estados Unidos) con un pullback continuo a 0,5 mm/s. Antes del análisis, el pullback se procesó con un sistema de gating retrospectivo basado en imágenes (Intelligate)⁹. Las mediciones del lumen se realizaron con un software para análisis cuantitativo (CURAD BV)^4,5.

Adquisición y análisis de OCT

La adquisición de las imágenes de OCT se realizó con el mismo sistema previamente descrito para el estudio ex vivo . Primero se realizó un pullback con oclusión seguido de un segundo pullback a través del mismo segmento sin oclusión.

Técnica oclusiva: el balón de oclusión (Helios, Goodman Inc., Japón) se avanzó distal a la región de interés a través una guía de angioplastia convencional (0,014''). A continuación, la guía se intercambió por la ImageWire y el balón de oclusión se posicionó proximal al segmento de interés. El pullback de la ImageWire se realizó durante el inflado del balón de oclusión proximal a baja presión (0,4 atm) con inyección simultánea distal de ringer lactato (37 °C a 0,8 ml/s). Las imágenes fueron adquiridas a 1 mm/s.

Técnica no oclusiva: la ImageWire se avanzó en la arteria utilizando un catéter de doble lumen (Twin Pass catheter, Vascular Solutions Inc.). El pullback se realizó durante inyección continua de contraste (3 ml/s, Iodixanol 320, Visipaque^TM, GE Health Care, Cork, Irlanda) a través del catéter guía con una bomba de inyección. En este caso, la velocidad del pullback fue 3 mm/s.

Las mediciones del lumen se realizaron con el software para análisis (LightLab Imaging Inc., Westford, Massachusetts, Estados Unidos). En todos los estudios con OCT, el índice de refracción se ajustó en función de la solución utilizada para la inyección durante la adquisición de las imágenes (SS, ringer lactato y contraste radiológico, respectivamente).

Identificación de segmentos correspondientes en IVUS y OCT

La región en estudio se localizó en los 3 pullbacks (IVUS, OCT con oclusión y OCT sin oclusión) utilizando marcas como ramas laterales (fig. 2). Para una adecuada comparación por sección entre los dos pullbacks con OCT, se realizó un ajuste para la diferencia en la velocidad del pullback .

Fig. 2. Selección de la región de interés en los pullbacks de tomografía de coherencia óptica (OCT) adquiridos con y sin oclusión. PB1 y PB2 muestran la vista longitudinal de los pullbacks adquiridos con y sin oclusión respectivamente. Las flechas blancas indican las ramas laterales (RLA y RLB) utilizadas para la selección de regiones de interés correspondientes en los dos pullbacks. 1A y 2A muestran imágenes correspondientes de RLA con y sin oclusión. 1B y 2B muestran imágenes correspondientes de RLB con y sin oclusión.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con SPSS 12.0.1 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, Estados Unidos). Las variables continuas se expresan como media ± desviación estándar y las variables categóricas, en porcentajes. Se calcularon las diferencias absolutas y relativas entre las mediciones obtenidas con las diferentes técnicas. La diferencia relativa se definió como la diferencia absoluta dividida por la media. Los resultados se expresan también en gráficos de Bland-Altman, que muestran la diferencia absoluta entre las mediciones del lumen para las dos técnicas (eje y ) frente a la media de ambas técnicas (eje x ). Los límites de acuerdo se calcularon como la diferencia absoluta media ± 2 desviaciones estándar.

RESULTADOS

Arterias coronarias humanas ex vivo

Se obtuvieron imágenes de IVUS y OCT en 8 de las 10 muestras. En dos casos no fue posible adquirir imágenes intracoronarias debido a la oclusión total del lumen. En 35 secciones fue posible identificar adecuadamente imágenes correspondientes en IVUS, OCT e histología. Las áreas medias del lumen, la placa y el vaso medida por histología fueron 2,5 ± 1,7, 3,7 ± 1,9 y 7,6 ± 3,2 mm² respectivamente. El porcentaje medio de estenosis fue 59% ± 18%.

Para las mediciones del área del lumen obtenidas con las tres modalidades de imagen, se realizaron gráficos de Bland-Altman y análisis de regresión (fig. 3). Las diferencias relativas medias para las mediciones del lumen fueron el 28% entre OCT e histología, el 40% entre IVUS e histología y el 11% entre IVUS y OCT.

Fig. 3. Dimensiones del lumen en arterias coronarias ex vivo. Gráficas de Bland-Altman que muestran las diferencias en las mediciones del lumen entre tomografía de coherencia óptica (OCT) e histología (A), ecografía intravascular (IVUS) e histología (B) y OCT e IVUS (C). Correlación entre las medidas del lumen en OCT e histología (A'), IVUS e histología (B') y OCT e IVUS (C').

Arterias coronarias humanas in vivo

Características clínicas y del procedimiento

Se incluyó en el estudio a 5 pacientes (5 vasos). La media de edad fue 61,2 ± 8,9 años; 4/5 pacientes eran varones; de ellos, 3 tenían hipertensión; 1, diabetes, y 4, hiperlipemia; ninguno era fumador. El vaso evaluado fue la DA en 1 caso y la CX en los 4 restantes. Sólo 1 paciente tuvo durante la adquisición de OCT con oclusión dolor torácico y descenso del segmento ST, que desaparecieron inmediatamente tras desinflar el balón.

Comparación de las dimensiones del lumen con IVUS y OCT

Las áreas medias del lumen, la placa y el vaso medidos por IVUS fueron 6,3 ± 1, 6,9 ± 1,4 y 13,3 ± 1,7 mm² y el porcentaje medio de estenosis, 52 ± 6%.

-Comparación IVUS y OCT con oclusión

La diferencia relativa media para el área luminal media fue del 33,7% y la diferencia absoluta media para el área luminal media, 1,67 ± 0,54 mm², con un intervalo de acuerdo de 0,62-2,73 mm² (tabla 1). La diferencia relativa media para el área luminal mínima (ALM) entre IVUS y OCT con oclusión fue del 55,5% y la diferencia absoluta media, 1,9 ± 0,37 mm², con intervalo de acuerdo de 1,17-2,63 mm².

-Comparación IVUS y OCT sin oclusión

La diferencia relativa media para el área luminal media fue del 21,5% y la diferencia absoluta, 1,11 ± 0,53 mm², con un intervalo de acuerdo de 0,05-2,14 mm² (tabla 2). La diferencia relativa media para el ALM fue del 29% y la diferencia absoluta media, 1,1 ± 0,37 mm², con un intervalo de acuerdo de 0,37-1,83 mm².

Comparación de las dimensiones del lumen en OCT con y sin oclusión

Para la comparación de las dimensiones del lumen en OCT, se analizaron 373 secciones correspondientes obtenidas con y sin oclusión (fig. 4). La longitud media de la región analizada fue 11,34 ± 3,87 mm con oclusión y 11,23 ± 3,86 mm sin oclusión (p = 0,96). También para estas mediciones se realizó gráfica de Bland-Altman y análisis de regresión (fig. 5).

Fig. 4. Ejemplos de las diferencias en las dimensiones del lumen en tomografía de coherencia óptica (OCT) con y sin oclusión. La figura muestra imágenes correspondientes adquiridas con oclusión (A, B y C) y sin oclusión (A', B' y C'). Las flechas blancas indican las marcas utilizadas para la selección de segmentos correspondientes (ramas laterales en A y C y placa calcificada en B). En todos los ejemplos las dimensiones del lumen son menores en el pullback adquirido con oclusión.

Fig. 5. Comparación de las dimensiones del lumen con tomografía de coherencia óptica (OCT) con y sin oclusión. A: la gráfica de Bland-Altman muestra las diferencias en las mediciones del lumen en imágenes de OCT adquiridas con las técnicas oclusiva y no oclusiva. B: correlación entre las mediciones del lumen en imágenes de OCT adquiridas con y sin oclusión del vaso.

La diferencia absoluta y relativa media para el área luminal media fue 0,61 ± 0,23 mm² (13%) (intervalo de acuerdo, 0,15-1,07 mm²). La diferencia absoluta y relativa media para el ALM fue 0,8 ± 0,21 mm² (28%) (intervalo de acuerdo, 0,37-1,23 mm²) (tablas 3 y 4).

Los volúmenes luminales medios fueron 55 ± 29,5 y 60,4 ± 30,4 ml ³ con y sin oclusión, respectivamente, con una diferencia relativa del 11,7%. La diferencia absoluta media fue 5,4 ± 2,7 ml ³ (intervalo de acuerdo, 0-10,7 ml³ ).

DISCUSIÓN

La OCT está emergiendo como una de las técnicas de diagnóstico intracoronario más prometedoras debido a su capacidad para visualizar la arteria coronaria con alta resolución. Esta técnica permite un análisis muy detallado de la placa aterosclérotica y de la interacción entre el stent y la pared del vaso10,11.

En los últimos años, se ha producido un desarrollo tecnológico continuo que ha permitido cambiar la técnica de adquisición (pasando de la necesidad de ocluir el vaso a un procedimiento sin oclusión), con el objetivo de simplificar el uso de esta modalidad de imagen y reducir los riesgos para el paciente^12,13.

Sin embargo, la técnica no oclusiva continúa siendo off-label, incluso cuando hoy ya está reemplazando gradualmente a la técnica oclusiva en múltiples centros. Además, la mayoría de los estudios con OCT publicados recientemente fueron realizados con la técnica oclusiva^14-20. El impacto de la técnica de adquisición en las mediciones del lumen obtenidas con OCT en comparación con IVUS no ha sido publicado previamente. El presente estudio muestra que, en arterias coronarias humanas fijadas, el IVUS y la OCT sobrestiman el área del lumen en comparación con la histología, las dimensiones del lumen son más grandes en IVUS que en OCT con o sin oclusión in vivo , y la técnica de adquisición de OCT (con o sin oclusión) influye en las dimensiones del lumen.

Diferencias en las dimensiones del lumen entre IVUS, OCT e histología

En el presente estudio, el área del lumen fue más grande en IVUS y OCT que en histología en arterias coronarias humanas fijadas. La diferencia media con histología fue de 0,8 mm² (28%) para OCT y 1,3 mm² (40%) para IVUS. Estos resultados están en línea con los de un estudio previo en arterias coronarias porcinas tratadas con stent, que demostró como el área del lumen era más grande en IVUS y OCT y más pequeña en histología²¹.

Sin embargo, se debe tener en consideración que el procesamiento de la muestra ex vivo para el análisis histológico podría haber influido en las dimensiones del lumen. Es un hecho bien establecido que en diferentes fases de la preparación para histología se produce contracción del tejido²².

En cuanto a la comparación de IVUS y OCT, los resultados obtenidos in vivo son acordes con los hallazgos ex vivo. En nuestro estudio, las dimensiones del lumen medidas por IVUS en pacientes fueron siempre más grandes que las dimensiones medidas por OCT con o sin oclusión. Los diversos estudios publicados que comparan las dimensiones del lumen medidas por IVUS y OCT muestran resultados contradictorios. Kawase et al²³, realizaron IVUS y OCT con oclusión in vivo en seis arterias coronarias en cerdos y no encontraron diferencias en área y volumen del lumen entre IVUS y OCT con oclusión. Sin embargo, otro estudio²¹ en arterias coronarias porcinas con una muestra mayor demostró una diferencia absoluta de 0,49 mm² en el área luminal media obtenida con IVUS y OCT con oclusión en segmentos tratados con stent. Yamaguchi et al² evaluaron las diferencias in vivo en humanos y observaron que el ALM era significativamente más pequeña en OCT con oclusión que en IVUS (diferencia media, 0,4 mm²). Las diferencias más amplias encontradas en nuestro estudio podrían explicarse por el hecho de que no se incluyeron segmentos coronarios tratados con stents metálicos. Debido a su considerable fuerza radial, es probable que los stents metálicos se afecten menos por la variación en la presión intracoronaria producida por la oclusión proximal.

Hasta el momento no hay datos publicados acerca de las diferencias en las medidas del lumen entre IVUS y OCT con técnica no oclusiva. En el presente estudio, las dimensiones del lumen también fueron más grandes en IVUS que en OCT sin oclusión, pero las diferencias, como era de esperar, fueron más pequeñas que las encontradas entre IVUS y OCT con oclusión.

La sobrestimación de las dimensiones del lumen por IVUS en comparación con OCT podría estar relacionada con la dificultad para diferenciar el borde luminal en IVUS debido a la presencia de sangre y artefactos²⁴. En comparación, la OCT muestra la interfaz lumen-íntima como un borde muy bien definido y claramente visible en la mayoría de los casos²⁵. El IVUS también sobrestima el área del lumen respecto a la angiografía cuantitativa (videodensitometría y detección de bordes)^26-28. En nuestro estudio, las diferencias en las dimensiones del lumen entre IVUS y OCT fueron más grandes in vivo que ex vivo. Esto podría estar relacionado con la selección de las imágenes para análisis in vivo. El pullback de IVUS obtenido in vivo fue procesado con un sistema de gating que selecciona las imágenes en telediástole (el momento del ciclo cardiaco en que el vaso es más grande), mientras que en el pullback de OCT las imágenes no fueron seleccionadas y, por lo tanto, pueden corresponder a cualquier momento del ciclo cardiaco. Estudios previos con IVUS indican que el área luminal puede variar en torno al 8% durante el ciclo cardiaco²⁹.

Las diferencias en las mediciones del lumen entre IVUS y OCT pueden tener implicaciones clínicas si se va a usar la OCT para definir la severidad de la lesión coronaria. Un ALM < 4 mm² por IVUS se ha asociado con isquemia miocárdica y ha sido considerado un criterio indicativo de la necesidad de revascularización. En nuestro estudio, todos los pacientes tenían un ALM > 4 mm² por IVUS, pero 4 de los 5 pacientes tenían un ALM < 4 mm² medida por OCT con oclusión. Todos los pacientes estaban asintomáticos y no fueron tratados. Estos resultados indican que los criterios definidos para IVUS no pueden ser trasladados directamente a OCT y enfatizan la necesidad de nuevos puntos de corte específicos para definir severidad de la lesión coronaria por OCT.

Impacto de la técnica de adquisición de OCT en las dimensiones del lumen

El presente estudio muestra de una forma consistente que el ALM y el área luminal mínima fueron siempre más pequeñas cuando las imágenes de OCT fueron adquiridas con oclusión del vaso que cuando el pullback fue adquirido sin oclusión. Estas diferencias podrían estar relacionadas con el descenso en la presión intracoronaria debido a la oclusión del vaso, que no se compensa completamente con la inyección continua de suero. Además, la inyección de contraste durante el procedimiento no oclusivo incrementa la presión intracoronaria (fig. 6). Estos fenómenos probablemente sean más acentuados en arterias sanas y en segmentos coronarios no tratados con stents metálicos (como es el caso de los vasos evaluados en nuestro estudio). Las diferencias relativas fueron más grandes en los vasos más pequeños, lo que podría reflejar una mayor tendencia de estas arterias a colapsarse con la oclusión del vaso.

Fig. 6. Registro de presión intracoronaria durante la inyección de solución salina o contraste. La figura muestra el ECG (rojo) y el registro de presión intracoronaria (azul) obtenido en una arteria coronaria descendente anterior durante la inyección de suero salino o contraste (Iodixanol 320, Visipaque^TM, GE Health Care, Cork, Irlanda). La presión intracoronaria distal fue registrada utilizando el sistema de guía de presión RADI^TM (RADI Medical Systems). La inyección de suero salino a 3 ml/s no modificó significativamente la presión intracoronaria (A). Sin embargo, durante la inyección de contraste a 3 ml/s se puede observar un incremento en la presión intracoronaria (B). *Extrasístole ventricular.

Limitaciones

Aunque se utilizó un proceso complejo para seleccionar imágenes correspondientes en IVUS, OCT e histología, no se puede descartar que la diferencia en el grosor de la sección entre las tres técnicas haya tenido influencia en los resultados en el estudio ex vivo. Las mayores limitaciones del estudio in vivo son el pequeño tamaño de la muestra y la escasa variedad de segmentos coronarios que se pudo analizar. La evaluación de diferencias cuantitativas entre pullbacks de OCT adquiridos con diferentes técnicas e IVUS en arterias coronarias humanas tratadas con stents metálicos requiere más investigación. Son necesarios nuevos estudios que incluyan a más pacientes y diferentes tipos de segmentos coronarios antes de poder obtener conclusiones definitivas.

CONCLUSIONES

En arterias coronarias humanas fijadas, IVUS y OCT sobrestimaron el área del lumen en comparación con la histología. Las dimensiones del lumen fueron más grandes en IVUS que en OCT con o sin oclusión in vivo. La técnica de adquisición de OCT (con o sin oclusión) influye en las dimensiones del lumen.

ABREVIATURAS
ALM: área luminal mínima.
CX: circunfleja.
DA: descendente anterior.
IVUS: ecografía intravascular.
OCT: tomografía de coherencia óptica.

Full English text available from: www.revespcardiol.org

V éase editorial en págs. 599-602

Correspondencia: Dr. E. Regar.
Thoraxcenter, Bd 585. 's-Gravendijkwal 230. 3015-CE Rotterdam. Países Bajos.
Correo electrónico: e.regar@erasmusmc.nl

Recibido el 13 de enero de 2009.

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