La arteriosclerosis, compleja enfermedad crónica de la pared arterial, es la base etiológica de la mayor parte de los episodios cardiovasculares, entre los que se incluye la enfermedad cardiaca coronaria (fig. 1). La aterosclerosis tiene una etiología multifactorial y se desencadena por factores tanto sistémicos como locales que inducen un deterioro de la función vascular. La hipercolesterolemia y especialmente las concentraciones plasmáticas elevadas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) son un factor de riesgo relevante de aparición prematura de aterosclerosis y cardiopatía isquémica¹.

Fig. 1. Arterias coronarias humanas con diferentes tipos de lesión aterosclerótica. A: placa aterosclerótica compleja vulnerable, con centro necrótico (nc) de gran tamaño y una delgada capa fibrosa (cf). B: placa erosionada con trombo (tr) superpuesto. Tinción de hematoxilina-eosina.

Los lípidos son moléculas orgánicas e insolubles o con muy reducida solubilidad en medios acuosos debido a que son muy hidrófugos. Las lipoproteínas son estructuras compuestas de proteínas y fosfolípidos que facilitan el transporte de lípidos en el torrente circulatorio. Específicamente, las LDL son una clase heterogénea de lipoproteínas de densidad entre 1,019 y 1,063 g/ml y un diámetro de 20-25 nm. Las LDL consisten en un núcleo hidrófugo que contiene triglicéridos y ésteres de colesterol y una cubierta hidrófila formada por fosfolípidos, colesterol libre y proteínas, predominantemente la apolipoproteína B-100, que actúa de ligando con receptores de la membrana celular (fig. 2).

Fig. 2. Esquema gráfico de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y de baja densidad (LDL). Principales componentes proteínicos y lipídicos. Apo: apolipoproteína.

En zonas de la pared vascular con predisposición a las lesiones ateroscleróticas, con una permeabilidad aumentada, la hipercolesterolemia plasmática está asociada con un aumento de transocitosis de LDL a través del endotelio vascular. Esto lleva a la acumulación de LDL en el espacio subendotelial, donde interaccionan con proteoglucanos y proteínas que favorecen su modificación (agregaciones, glucosilaciones, proteolisis enzimáticas, oxidaciones, etc.), lo que incrementa su aterogenicidad^2,3 y retención en la íntima vascular. La retención de LDL en la íntima arterial es un proceso clave en el inicio y la progresión de la lesión aterosclerótica, ya que dispara un proceso inflamatorio local. Las lesiones vasculares ateroscleróticas son el resultado de complejas interacciones entre células inflamatorias, plaquetas, elementos vasculares y lipoproteínas que regulan la expresión de genes y proteínas directamente involucradas en el proceso de remodelado vascular (fig. 3).

Fig. 3. Representación esquemática de la evolución de la placa aterosclerótica desde etapas iniciales de disfunción endotelial a etapas avanzadas con la presencia de placas complicadas. FT: factor tisular; M-CSF: factor estimulador de colonias de macrófagos; MCP-1: proteína quimiotáctica de monocitos; MMP: metaloproteinasas; PAI-1: inhibidor del del plasminógeno tipo-1 activado; PDGF: factor de crecimiento plaquetario; UPA: activador del plasminógeno tipo uroquinasa.

LIPOPROTEÍNAS Y DISFUNCIÓN ENDOTELIAL

El endotelio vascular es un órgano multifactorial, capaz de percibir estímulos (tanto sistémicos como locales) y modificar su estado funcional para contribuir a mantener la homeostasis de la pared vascular^4,5. En condiciones fisiológicas, el endotelio presenta una superficie con propiedades antitrombogénicas⁶ a través de la cual se produce el intercambio de numerosas sustancias entre la sangre y los tejidos y se controla el tono vascular y el tránsito de células inflamatorias hacia la pared vascular. El aumento de permeabilidad del endotelio en presencia de elevadas concentraciones de LDL se ha asociado recientemente a la actividad de la cinasa p21, por un mecanismo mediado por la proteincinasa G y la Ser/Thr cinasa Akt^7,8. Gran parte de las propiedades antiaterogénicas y antitrombóticas del endotelio vascular están mediadas por su capacidad de producir y liberar sustancias como el óxido nítrico (NO), molécula inhibidora de la agregación plaquetaria, con elevada actividad vasodilatadora y una importante función antiinflamatoria. El NO previene la expresión de moléculas proinflamatorias como el factor de necrosis (NF) κB y de moléculas de adhesión (ICAM-1, VCAM-1)⁹, así como la adhesión e infiltración de leucocitos¹⁰. Las conexiones intercelulares tipo tight junctions y gap junctions son estructuras esenciales en la regulación de la función y la permeabilidad del endotelio. La formación de gap junctions está regulada por la presencia y la funcionalidad de conexinas, proteínas cuya expresión se altera durante la formación de lesiones ateroscleróticas¹¹. Las gap junctions, además de favorecer los procesos de señalización intercelulares, regulan los procesos de vasodilatación dependientes del NO¹² (fig. 4).

Fig. 4. Diagrama simplificado de los efectos vasoprotectores del óxido nítrico. cLDL: colesterol de las LDL; LDL: lipoproteínas de baja densidad; NOS: óxido nítrico sintetasa.

Las concentraciones aterogénicas de LDL llevan a una disminución de la biodisponibilidad del NO endotelial. Esta menor disponibilidad de NO se ha asociado a una disminución en la concentración y/o la actividad de la NO sintetasa como consecuencia de la presencia de LDL nativas¹³ o modificadas14, así como a la degradación de NO por formación de aniones superóxido (O₂^-)^15-17.

El desequilibrio en NO/redox se ha asociado a la nitrosilación de proteínas. La inactivación de NO por O₂^- da lugar a radicales peroxinitrito, altamente citotóxicos. En lesiones ateroscleróticas humanas se ha descrito la presencia de peroxinitritos derivados de nitrosotironas y una elevada producción de O₂^-. Los peroxinitritos inhiben la expresión de prostaciclina sintetasa y favorecen su nitrosilación, proceso que se ha asociado recientemente a la disfunción endotelial inducida por los superóxidos en la enfermedad vascular.

RETENCIÓN Y MODIFICACIÓN DE LAS LDL EN LA ÍNTIMA ARTERIAL. EFECTO EN LA PROGRESIÓN DE LAS LESIONES ATEROSCLERÓTICAS

El remodelado vascular que tiene lugar durante el desarrollo y la complicación de las placas ateroscleróticas está condicionado en gran medida por la composición y la estructura de la matriz extracelular (MEC). Las células musculares lisas (CML) producen gran parte de los componentes mayoritarios de la MEC, como proteoglucanos, colágeno y elastina, así como un gran número de proteínas que determinan el balance entre síntesis (lisis oxidasa) y degradación (metaloproteinasas, activadores del plasminógeno) de la MEC durante el proceso aterogénico.

Las LDL sufren procesos de modificación cuando interaccionan con los componentes de la MEC o por acción de determinados agentes oxidantes (lipooxigenasas, mieloperoxidasa, radicales libres, etc.) y por la actividad de enzimas proteolíticas (cinasa, triptasa, metaloproteinasas, trombina, etc.), enzimas lipolíticas (esfingomielinasa, fosfolipasa A2, fosfolipasa C, etc.) y enzimas hidrolíticas (esterasa). De esta manera tienen lugar determinados procesos químicos y/o estructurales que generan distintos tipos de LDL modificadas¹⁸.

Los proteoglucanos son responsables del atrapamiento de las LDL en la íntima arterial. Los proteoglucanos tipo condroitinsulfato, como el versicán, son los principales proteoglucanos estructurales de la MEC y se considera que son importantes elementos aterogénicos, debido a la elevada capacidad que tienen para interaccionar, retener y agregar lipoproteínas ricas en colesterol; las partículas de LDL de menor densidad son las de mayor capacidad de interaccionar con los proteoglucanos. La longitud y el número de cadenas de glucosaminoglucanos en los proteoglucanos producidos por las CML, así como su grado de sulfatación, determinará la formación de complejos insolubles entre estas moléculas y la capacidad de retención de las LDL en la íntima arterial¹⁹.

La interacción entre versicán y LDL produce cambios estructurales en estas partículas lipoproteínicas que llevan a agregados de LDL similares a los que se obtienen mecánicamente por agitación y a los descritos en lesiones ateroscleróticas²⁰.

El colágeno es esencial para el mantenimiento de la integridad y la elasticidad de la pared vascular. Sin embargo, también está implicado en procesos de diferenciación celular, y sus formas glucosiladas son un importante factor de la aterogénesis, ya que favorecen la retención de LDL^21,22.

En contraste con las LDL nativas que son internalizadas específicamente por el receptor LDLR, nuestro grupo ha demostrado que las formas modificadas por agregación son internalizadas en las células por diferentes tipos de receptores, entre ellos LRP-1 (lipoproteína de baja densidad de receptor-1), receptor de la familia LDL que internaliza las LDL agregadas²³, receptores scavenger como SR-AI y SR-AII, CD36, LOX-1 o CXCL16 para las LDL oxidadas²⁴, y el receptor Fc gamma para LDL incorporadas en complejos inmunitarios²⁵. Los receptores LDLR, LRP-1 y scavenger se han descrito en los diferentes tipos de células con funciones clave en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas, como monocitos, CML y plaquetas.

LDL Y MONOCITOS/MACRÓFAGOS

Un proceso relevante durante el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas es la infiltración de monocitos circulantes al espacio intravascular. Las LDL, especialmente las formas modificadas, inducen el aumento en la expresión y la secreción de compuestos quimiotácticos solubles (MCP-1, interleucina [IL] 8)²⁶ y un aumento en la expresión de moléculas de adhesión como integrinas y selectinas^27,28, que quedan expuestas en la superficie de las células endoteliales activadas y favorecen el reclutamiento, la adhesión y la transmigración leucocitaria (monocitos, células T). La proteína quimiotáctica para monocitos MCP1 tiene un papel clave a través de los receptores CCR2. El hecho de que las diferentes moléculas de adhesión y moléculas quimiotácticas se expresen de forma casi simultánea en las células endoteliales (CE) indica una activación concertada de diferentes genes, a través de un factor de transcripción común como NF-κB²⁹. Además de los efectos en el endotelio vascular, las LDL modificadas favorecen la entrada de monocitos en la pared vascular por una acción directa sobre ellos, en un proceso que se cree mediado por CD11 y la vía de la proteincinasa C (PKC)³⁰.

La diapedesis de monocitos tiene lugar a través de los espacios intercelulares de las CE (junctions), preferentemente en áreas donde la lámina basal está enriquecida en LDL modificadas³¹. Los monocitos infiltrados en la íntima arterial se diferencian a macrófagos y expresan receptores scavenger tales como CD36 y LOX-1, que internalizan una cantidad elevada de moléculas de colesterol y ésteres de colesterol provenientes de LDL modificadas. Las LDL agregadas (LDLag) son un potente inductor de acumulación masiva de colesterol en macrófagos³²; mientras unos autores proponen la fagocitosis como mecanismo clásico de internalización de LDLag en macrófagos, otros autores, utilizando diseños experimentales que simulan la interacción in vivo entre los macrófagos de la pared y las LDL subendoteliales, han definido un nuevo mecanismo de internalización de estas lipoproteínas de baja densidad conocido como «patocitosis», que consiste en la captación de grandes cantidades de LDLag a través de formaciones vesiculares de la membrana³³. Recientemente se ha señalado que el receptor LRP-1 participa en la internalización por los macrófagos de LDL retenidas en la matriz y LDL degradadas por esfingomielinasa³⁴ en un proceso regulado por SREBP1 y SREBP2, que controlan la expresión de ese receptor³⁵. La internalización de colesterol da lugar a las células espumosas, que son uno de los constituyentes celulares característicos en la lesiones ateroscleróticas. Las células espumosas secretan a su vez citocinas proinflamatorias, factores de crecimiento, factor tisular³⁶, interferón (IFN) δ, MMP y especies reactivas de oxígeno (ROS) que mantienen un estímulo quimiotáctico para leucocitos adheridos al endotelio vascular, aumentan la expresión de receptores scavenger, promueven la replicación de macrófagos²⁶ y regulan la acumulación de CML en la íntima³⁷.

LDL Y CML

Las CML son el componente celular mayoritario en la pared vascular, por lo que tienen un papel clave en la función vascular. Las CML están implicadas tanto en la iniciación como en la progresión y la complicación de las lesiones ateroscleróticas. Las CML se caracterizan por una elevada plasticidad. Bajo el efecto de estímulos aterogénicos, las CML sufren cambios fenotípicos que conllevan su desdiferenciación y la adquisición de un fenotipo sintético. Así, las CML de fenotipo contráctil no proliferativo, típico de arterias sanas, se transforman en células que proliferan activamente (fenotipo sintético), migran atraídas por agentes quimiotácticos y tienen incrementada la síntesis de MEC. De hecho, la migración de CML de la media a la íntima vascular es un proceso clave en el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas. Datos recientes indican que, además de la migración de CML residentes en la pared vascular desde la media a la íntima, células progenitoras circulantes provenientes de la médula ósea y células progenitoras presentes en la adventicia de los vasos también son una fuente de CML en la íntima³⁸.

Estudios funcionales con animales alterados genéticamente o cultivos celulares demuestran que ciertos componentes de la familia de los receptores relacionados con las LDL modulan la migración celular a través de procesos de señalización mediados por citocinas y la activación de proteinasas³⁹.

En presencia de LDLag, las CML sobreexpresan receptores como LRP-1 que, además de facilitar la internalización de LDL y la transformación de las células en espumosas²⁰, actúa como receptor de diferentes ligandos y participa en procesos de señalización. En animales hipercolesterolémicos, el análisis de ARN mensajero por hibridación in situ muestra un aumento de LRP-1 en la pared vascular²⁰, lo que indica que la hipercolesterolemia podría favorecer la captación de LDL por la CML debido a su capacidad de regular la cantidad de LRP-1. Además, una mayor expresión del receptor LRP-1 podría estar influyendo en otros procesos relevantes de la aterotrombosis, ya que el LRP-1 media la internalización y la degradación de complejos moleculares relevantes en la proteolisis y la fibrinolisis. Así, el LRP-1 puede interaccionar directa o indirectamente con diferentes miembros de la familia de las MMP, y se ha demostrado su participación en el catabolismo de la MMP9 en fibroblastos.

CML y MMP9 en la aterogénesis

La MMP9 es una metaloproteinasa perteneciente al grupo de las gelatinasas, que en la pared vascular se expresa en CML y macrófagos y se secreta en forma latente a la matriz extracelular, donde es activada por plasmina en un proceso mediado por el activador del plasminógeno tipo uroquinasa (UPA). La MMP9 está sobreexpresada en procesos de reestenosis y procesos de migración de las CML. Evidencias recientes demuestran⁴⁰ que la inducción de transcripcción de la MMP9 por citocinas y factores de crecimiento aterogénicos está regulada por la proteína Foxo4, a través de la vía de señalización de JNK/MST1. La MMP9 es una enzima proteolítica de diferentes proteínas de la matriz extracelular como colágeno tipo IV, laminina y elastina⁴¹, que favorecen el remodelado de la pared vascular. Así, ratones apoE-/- deficientes en MMP9 tienen lesiones ateroscleróticas de menor tamaño que los ratones apoE-/- con expresión normal de MMP9⁴².

CML y sistema UPA/receptor del UPA (UPA/UPAR) en aterogénesis

El UPA, unido a su receptor UPAR (CD87), regula de forma directa o en un proceso mediado por la generación de plasmina los mecanismos de proteolisis pericelular que se requieren en procesos de migración y proliferación celular⁴³. Además, hay cada vez más pruebas de que el sistema UPA/ UPAR cumple una función como ligando-inductor de mecanismos de señalización celular en proliferación y migración⁴⁴ (fig. 5).

Fig. 5. Localización de UPA y UPAR en CML de coronarias humanas en migración. A: microscopia de contrastre de fases que muestra células migrando hacia una zona de lesión (desprovista de células) inducida mecánicamente en una monocapa confluente de CML humanas. B: microscopia confocal de fluorescencia para UPA y UPAR (señal verde) y actina (señal roja) en células situadas en el borde de la lesión (señalizada por flechas). Núcleos teñidos en azul con tinción azul fluorescente de Hoescht. CML: célula muscular lisa; UPA: activador del plasminógeno tipo uroquinasa; UPAR: receptor del activador del plasminógeno tipo uroquinasa.

La forma soluble de un miembro de la familia de receptores de las LDL, el LR11 o sorLA, altamente expresado en CML, aumenta la capacidad de migración de las CML en un proceso mediado por el aumento de expresión de UPAR. Estudios en ratones genéticamente deficientes en LR11 indican que las formas solubles de LR11 favorecen la formación de lamelopodios de las CML conformando complejos LR11-UPAR-integrinas (ανβ3) y que este proceso es necesario para la adhesión y la migración de CML inducida por componentes aterógenos como la angiotensina II⁴⁵.

En células en migración, el receptor UPAR anclado en la membrana celular se redistribuye focalmente en zonas de adhesión en la parte apical de las células, donde interacciona con diferentes integrinas de membrana. Parece que la interacción entre UPAR e integrina promueve la reorganización del citoesqueleto de actina de la célula durante los procesos de migración⁴⁶. Trabajos recientes de nuestro grupo han puesto en evidencia que en presencia de concentraciones aterogénicas de LDL hay una alteración en la localización subcelular de UPA y UPAR en CML vasculares humanas en migración y su colocalización con el citoesqueleto de actina⁴⁷, lo que podría contribuir al efecto inhibitorio que las LDL han demostrado in vitro en la capacidad de migración de las CML vasculares humanas⁴⁸.

Las LDL modificadas (degradación enzimática) pueden favorecer in situ procesos inflamatorios de fase aguda mediados por las CML. Las LDL inducen en estas células la síntesis de PTX3, proteína perteneciente a la familia de las pentraxinas, a la que también pertenecen la proteína C reactiva y el amiloide P sérico⁴⁹, con lo que también contribuyen al proceso aterogénico.

PLAQUETAS Y ATEROSCLEROSIS

Componentes celulares como las plaquetas y posiblemente las células progenitoras tienen también una función relevante en la patogenia de la arteriosclerosis. Las plaquetas son corpúsculos celulares sintetizados en la médula ósea a partir de los megacariocitos. Las plaquetas carecen de ADN, pero contienen ARN mensajero derivado de los megacariocitos y la maquinaria de transcripción necesaria para la síntesis de proteínas⁵⁰. Las plaquetas, además de su bien conocida función en la trombosis y la hemostasis, contribuyen a la activación endotelial y modulan respuestas inflamatorias, con lo que favorecen el inicio y la formación de lesiones ateroscleróticas y sus posteriores complicaciones trombóticas^{51, 52}.

Efecto de las lipoproteínas en la función plaquetaria

Las alteraciones en la composición y la función plaquetarias en pacientes con hipercolesterolemia indican que las lipoproteínas circulantes afectan al fenotipo de las plaquetas⁵³. Las lipoproteínas afectan a la función plaquetaria mediante su unión a receptores específicos (como CD36, SR-B1, LOX-1)⁵⁴. Sin embargo, hasta ahora no hay suficientes evidencias de que las LDL nativas simplemente se unan a la superficie plaquetaria o se internalicen en vesículas intracelulares por un proceso de endocitosis. Las LDL nativas alteran la función plaquetaria por la activación de señales de transducción o por intercambio lipídico. Así, las LDL nativas pueden inducir la síntesis o translocación de fosfolípidos de la membrana plaquetaria o favorecer la inserción de fosfolípidos de la circulación y, en consecuencia, alterar la composición fosfolipídica de la membrana plaquetaria⁵⁵. Por el contrario, la unión de LDL oxidadas a la superficie plaquetaria induce la activación, el cambio de forma y la agregación de las plaquetas, lo que contribuye a la formación de trombos, especialmente tras la rotura de una placa⁵⁶.

Propiedades antitrombóticas del endotelio

En condiciones fisiológicas, cerca de 1,5 x 10¹² plaquetas circulan continuamente por el árbol arterial sin interaccionar significativamente con la pared arterial. La carga negativa presente en las plaquetas y las glucoproteínas de la pared vascular produce un primer efecto de repulsión que evita la interacción entre plaqueta y vaso. Además, son tres las vías principales por las que el endotelio vascular controla la reactividad plaquetaria: a) la vía del ácido araquidónico-prostaciclina; b) la vía de la L-arginina-óxido nítrico, y c) la vía de la ectoadenosina difosfatasa (ecto-ADPasa o CD39)⁵⁷. Las células endoteliales son capaces de convertir ácido araquidónico en prostaciclina gracias a la ciclooxigenasa (COX) 1 o la COX-2 y la sintetasa de la prostaciclina. La prostaciclina, a su vez, inhibe la función plaquetaria mediante aumento intracelular de AMP cíclico (AMPc)⁵⁸. De hecho, en nuestro grupo hemos demostrado que la inhibición selectiva de la COX-1 conlleva protección vascular por la disponible síntesis de prostaciclina a través de la COX-2 vascular⁵⁹. En cuanto a la vía del NO, una vez sintetizado por el endotelio a partir de la L-arginina, se difunde a las plaquetas y estimula la producción de GMP cíclico (GMPc). A su vez, el GMPc regula las proteincinasas dependientes de GMPc y causa una reducción en el flujo de Ca₂⁺ intracelular. Esta disminución previene el cambio conformacional de la glucoproteína (GP) IIb/IIIa y disminuye la interacción plaqueta-plaqueta detallada más adelante⁵⁸. Finalmente, en cuanto a la ecto-ADPasa, es un componente integral de la superficie del endotelio que se activa en función de la concentración de sustrato, con lo que se limita la concentración plasmática de nucleótidos (adenosindifosfato [ADP] y adenosintrifosfato [ATP]). De este modo, la actividad de esta enzima frena la fase crítica de reclutamiento y activación plaquetarios al ir removiendo los nucleótidos en el entorno fluido⁶⁰.

Junto con estas tres vías, el endotelio ofrece otros mecanismos que permiten modular la formación del trombo al actuar, principalmente, sobre la vía de la coagulación sanguínea. Entre ellos encontramos: a) la vía del heparansulfato y la trombomodulina: ambos son componentes integrales del endotelio vascular y median la activación de la antitrombina III y la proteína C, respectivamente, y bloquean así la síntesis de trombina (potente agonista plaquetario), y b) síntesis y liberación del activador tisular del plasminógeno, que limita la estabilización del trombo al promover la degradación de la malla de fibrina.

Plaquetas y disfunción endotelial

La disfunción/activación endotelial por sí misma es capaz de inducir la adhesión de las plaquetas a la pared vascular sin la necesidad de exponer superficies más profundas del vaso (p. ej., matriz vascular) al torrente circulatorio. De hecho, la disponibilidad de nuevas herramientas de investigación in vivo, tales como el microscopio intravital o modelos murinos genéticamente modificados de enfermedad cardiovascular, ha ayudado a demostrar que la denudación endotelial no es un requisito absoluto para que se produzca la adhesión y la posterior activación plaquetaria a la pared vascular^61,62. Se ha postulado que los mecanismos moleculares de la activación plaquetaria en las etapas iniciales de la lesión aterosclerótica comprenden: a) una reducción en los mecanismos implicados en el mantenimiento de las propiedades antitrombóticas; b) una generación elevada de especies reactivas de oxígeno por los factores de riesgo (hipertensión, hipercolesterolemia, tabaquismo y diabetes se correlacionan con un mayor número de plaquetas activas circulantes)^63-66, y c) un aumento de los mediadores protrombóticos y proinflamatorios tanto circulantes como inmovilizados en el endotelio⁶⁷. En este sentido, el endotelio es capaz de secretar grandes cantidades de factor de Von Willebrand (FvW) en respuesta a diversos estímulos inflamatorios, lo que promueve el reclutamiento de plaquetas.

Adhesión y activación plaquetarias

Actualmente, está bien establecido que la unión inicial (rolling) de las plaquetas al endotelio disfuncional está mediado, principalmente, por la unión entre la GP Ibα plaquetaria y el FvW endotelial, así como a la molécula de adhesión endotelial P-selectina⁶¹. De hecho, al igual que el FvW, la P-selectina se encuentra tanto en los gránulos alfa de las plaquetas como en los cuerpos de Weibel-Palade en las células endoteliales⁶⁸, y tras la activación celular se transloca rápidamente hacia la superficie celular, donde se mantiene expuesta durante al menos 1 h⁶⁸. De hecho, se considera que la P-selectina es un importante marcador de enfermedad vascular, dado que diversos estudios han demostrado que las plaquetas aumentan la expresión de P-selectina en su superficie a medida que evoluciona la formación de lesiones ateroscleróticas⁶⁹. Además de la expresión de FvW y P-selectina por las CE disfuncionales, el endotelio disfuncional también expresa selectinas, integrinas (molécula de adhesión vascular tipo-1 [VCAM-1]), el receptor de la vitronectina ανβ3 y la molécula de adhesión del endotelio celular y plaquetaria (PECAM-1), las cuales favorecen la adhesión de las plaquetas a la pared vascular.

Tras el daño vascular, la dinámica del depósito plaquetario y la consiguiente formación del trombo se regulan localmente por: a) el grado de estenosis; b) el tipo de lesión, y c) la composición de la placa aterosclerótica^70,71. La fisura o rotura de una placa aterosclerótica en las arterias coronarias, ya sea de manera espontánea o inducida (intervenciones de revascularización), con la consiguiente formación del trombo, es fundamental para el desarrollo de los síndromes isquémicos agudos, como ha sido plenamente demostrado en estudios de tejidos de pacientes que murieron repentinamente o poco después de un episodio de angina inestable o de infarto de miocardio⁷². En pacientes asintomáticos y aquellos con angina estable, la organización de dicho trombo es importante en la progresión de la arteriosclerosis. La rotura de la placa aterosclerótica expone componentes de la matriz vascular (p. ej., diferentes tipos de colágenos, FvW, fibronectina, laminina, fibulina y tromboespondina)⁷³ al torrente circulatorio que favorecen la interacción entre plaqueta y pared vacular. El FvW plasmático es fundamental en la formación del trombo a velocidades de cizalladura elevadas (> 650/s), típicas de vasos de calibre medio o de mayor tamaño parcialmente ocluidos. Esto se debe, principalmente, a que las condiciones de alta velocidad de flujo inducen un cambio conformacional del FvW, que permite exponer los dominios A3 de sus multímeros al colágeno vascular (colágeno tipo I y tipo III en las capas vasculares más profundas y colágeno tipo VI en capas subendoteliales). Esta unión con el colágeno induce, por un lado, un cambio conformacional del FvW en su dominio A1, lo que permite la interacción con el receptor GPIbα del complejo GPIb/IX/V plaquetario y, por otro, permite la interacción del dominio Arg-Gly-Asp (RGD) del FvW con el receptor plaquetario del tipo GPIIb/IIIa (integrina αIIbβ3)^74-76 (fig. 6). Sin embargo, la alta velocidad de disociación existente entre el FvW y la GPIb/V/IX hace que estas uniones no puedan pro-veer una unión estable entre las plaquetas y la matriz subendotelial⁷⁷. En contraste con la GPIb/V/IX, el receptor plaquetario GPVI se une directamente al colágeno e induce una activación de otros receptores de adhesión tales como las integrinas αIIbβ3 (GPIIb/IIIa) y la αIIβ1. Ambas actúan en concierto para promover una unión firme, estable e irreversible de las plaquetas al endotelio vascular^78,79, ya sea mediante la unión directa con el colágeno (αIIβ1) o con el dominio C1 del FvW (αIIbβ3)⁷⁷.

Fig. 6. Diagrama que ilustra el papel del factor de Von Willebrand (FvW) en la adhesión plaquetaria. Altas velocidades de flujo inducen cambios conformacionales del FvW que permiten la interacción de su dominio A3 con el colágeno de la matriz. Esto induce un cambio conformacional en su dominio A1, lo que permite que éste interaccione con el receptor plaquetario de la glucoproteína (GP) Ib-IX-V. Esta interacción estimula la liberación de calcio, la posterior activación plaquetaria y el consiguiente cambio conformacional del receptor del fibrinógeno (GPIIb/IIIa), que ya puede interaccionar con el fibrinógeno o el FvW para favorecer la interacción entre plaquetas (proceso de agregación plaquetaria). ADP: adenosindifosfato; RGD: secuencias de aminoácidos Arg-Gly-Asp.

A baja velocidad de cizalladura, la función de adhesión plaquetaria la realiza principalmente el receptor del colágeno que se enlaza directamente al receptor plaquetario GPIa-IIa (integrina α2β1)⁸⁰. Aunque en menor grado, también contribuyen la fibronectina, la laminina, la vitronectina y la tromboespondina, al enlazarse a la GPIc-IIa, GP Ic'-IIa, a los receptores para la vitronectina y la GPIV, respectivamente.

Cabe destacar que la presencia de agentes circulantes tales como epinefrina, trombina, tromboxano A₂ (TXA2) y ADP (liberado por eritrocitos hemolizados) también produce la activación plaquetaria a través de receptores plaquetarios específicos. En definitiva, se puede considerar que el colágeno y el FvW son los agonistas primarios en el proceso de activación-adhesión plaquetaria, que después el ADP liberado por los eritrocitos hemolizados en el área de la lesión vascular y la interacción con varios agonistas circulantes con sus receptores plaquetarios (fig. 7) favorecen y potencian.

Fig. 7. Representación esquemática de las principales vías de activación plaquetaria y dianas terapéuticas. AA: ácido araquidónico; ADP: adenosindifosfato; ATP: adenosintrifosfato; FvW: factor de von Willebrand; PAR: receptor activado por proteasas; PG: prostaglandina; PKA: proteincinasa tipo A; TP: receptor del tromboxano; TXA₂: tromboxano A₂.

Plaquetas y monocitos/macrófagos

Hay evidencia de que las plaquetas, al igual que los eritrocitos, penetran en la placa aterosclerótica a través de la rotura de capilares angiogénicos⁸¹. En zonas de daño endotelial, la estrecha interacción entre plaquetas y monocitos favorece la diferenciación de éstos a macrófagos y su transformación en células cebadas. A partir de estudios in vitro, se ha señalado que las plaquetas activadas pueden liberar colesterol, que sería internalizado por CML y macrófagos y almacenado en forma de gotas lipídicas⁸². Se ha descrito que las plaquetas inducen también la formación de células espumosas (CD68+) a partir de células progenitoras positivas para CD34. Evidencias recientes demuestran que este proceso puede prevenirse, al menos en parte, mediante inhibidores de la HMG-CoA reductasa y agonistas de los receptores peroxisome proliferator-activated⁸³.

Una vía alternativa de formación de células cebadas sería la fagocitosis de plaquetas por macrófagos residentes en la íntima vascular, teoría postulada hace ya cuatro décadas⁸⁴ confirmada recientemente mediante estudios in vitro que demuestran que la fagocitosis de plaquetas por macrófagos murinos resulta en la formación de macrófagos saturados de lípidos.

LIPOPROTEÍNAS Y ATEROTROMBOSIS

El mecanismo de la transformación brusca de una afección vascular estable en otra que pone en riesgo la vida del paciente suele ser la desestabilización de la placa con la superposición de procesos trombóticos que dan lugar a las manifestaciones clínicas⁸⁵. El riesgo de rotura de la placa aterosclerótica depende más de su composición y su vulnerabilidad (tipo de placa) que del grado de estenosis (tamaño de la placa). Diferentes estudios han revelado que más de un 75% de los infartos de miocardio ocurren en áreas donde las arterias coronarias presentan estenosis moderada (< 50%).

Características de las placas vulnerables

Los factores predominantes que afectan a la estabilidad de las placas ateroscleróticas son su composición celular y la proporción entre MEC y concentración lipídica. Las placas inestables y con alto riesgo de rotura contienen un importante núcleo lipídico, rico en ésteres de colesterol y pobre en colágeno, y un reducido número de CML, además de inflamación dentro de la cápsula, un elevado grado de neovascularización y fatiga. Mientras que en lesiones iniciales las CML representan un 90-95% del componente celular, la proporción decae hasta el 50% en las placas ateroscleróticas avanzadas⁸⁶. Estos datos indican la importancia de identificar y elucidar los mecanismos celulares que conllevan pérdida de CML en lesiones avanzadas, lo que podría favorecer el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.

Las concentraciones aterogénicas de LDL reducen significativamente la capacidad de migración de CML vasculares humanas⁴⁸. Mediante técnicas de análisis proteómico y microscopia confocal, recientemente nuestro grupo ha puesto de manifiesto que las LDL alteran la expresión y el perfil fenotípico de diferentes proteínas asociadas al citoesqueleto de las CML, especialmente de la cadena ligera de la miosina, tanto la isoforma esencial como la regulatoria, y además inducen una desfosforilación de ésta y una alteración en su localización subcelular⁴⁸. La fosforilación de la cadena ligera regulatoria de la miosina (MRLC) es un evento clave para la formación de complejos de actina-miosina durante la migración celular y dinámica de formación de fibras de actina. Este proceso está regulado también por proteínas como la gelsolina y la chaperona HSP27, cuyos perfiles proteómicos se modifican en CML expuestas a concentraciones aterogénicas de LDL⁸⁷. Además, la internalización de LDL por las CML induce una disminución en la actividad de la MMP9⁸⁸, lo que también podría estar potenciando el efecto inhibidor de la migración de CML que las LDL tienen y con ello contribuir a la inestabilidad y la vulnerabilidad de las placas en avanzado desarrollo.

Típicamente, las placas con una capa fibrosa delgada cubriendo el núcleo lipídico y un alto contenido en factor tisular (FT)³⁶ son las de mayor capacidad de rotura e inducción de trombosis⁸⁹. La proximidad del FT y las áreas ricas en lípidos en las lesiones ateroscleróticas avanzadas indican que las LDL están implicadas en la expresión celular de FT. En apoyo de esta hipótesis, se ha demostrado que las lipoproteínas modificadas afectan a la expresión y la actividad de FT en CML. Schecter et al⁹⁰ han propuesto que las CML tienen la capacidad de secretar micropartículas ricas en FT por un mecanismo independiente de los procesos de apoptosis celular. De hecho, hay evidencias de un aumento de micropartículas circulantes ricas en FT en pacientes con síndromes coronarios agudos y en pacientes con síndrome metabólico⁹¹.

Nuestro grupo ha demostrado que la interacción entre LRP-1 y LDL agregadas es uno de los mecanismos que inducen la expresión de FT, en un proceso que depende de la translocación de RhoA a membrana⁹² y la liberación de micropartículas enriquecidas en FT activo a la matriz extracelular⁹³.

Juntamente con las CML, los macrófagos son la otra fuente importante de FT en la pared arterial. La expresión de FT en monocitos parece estar regulada por PPARα⁹⁴. Las diferencias en los mecanismos de activación y secreción de FT en CML y macrófagos parecen depender de su distribución en la membrana plasmática. Así, el FT en CML se localiza preferentemente en las caveolas, mientras que en monocitos/macrófagos se encuentra prioritariamente en áreas enriquecidas en clatrina⁹⁵.

AGREGACIÓN PLAQUETARIA Y ATEROTROMBOSIS

Una vez activadas, las plaquetas sufren un cambio conformacional y reorganización y liberación del Ca₂⁺ intraplaquetario que gran parte originan los procesos de activación plaquetaria, tales como:

- La desgranulación plaquetaria. Ésta incluye la exocitosis del contenido de los gránulos alfa y los gránulos densos y lisosomales. ADP, serotonina y calcio liberado de los gránulos densos son clave en la función plaquetaria y el reclutamiento de nuevas plaquetas^96,97. Concretamente, el ADP tiene un efecto autocrino, pues promueve una agregación plaquetaria estable al interaccionar con receptores específicos del ADP presentes en la superficie de las plaquetas (P2Y₁ y P2Y12), pero también tiene efecto paracrino al unirse con receptores de ADP en plaquetas vecinas, lo que amplifica el proceso de activación plaquetaria inducido por otros agonistas. La liberación de los factores de crecimiento de los gránulos alfa inicia la reparación vascular y las citocinas (gránulos alfa), y las enzimas lisosomales (gránulos lisosomales) constituyen el vínculo con la respuesta inmunitaria.

- Síntesis de eicosanoides. La fosfolipasa A₂ inicia la vía de activación del ácido araquidónico, que se convierte en TXA₂ en una reacción catalizada por COX-1 (para formar prostaglandina G2/ H2) y tromboxano sintetasa (para formar TXA₂)⁹⁸. El TXA₂ se libera a la circulación, donde se une a los receptores del TXA (receptores TP) en la superficie de plaquetas adyacentes y/o células inflamatorias circulantes y presentes en la placa aterosclerótica, lo que amplifica y perpetúa el proceso aterotrombótico. De hecho, hemos demostrado que el bloqueo de los receptores TP se asocia a una marcada reducción del riesgo de trombosis inducida por stent intravascular99, además de sus ya descritas propiedades de inducir la regresión de la placa aterosclerótica vulnerable¹⁰⁰.

- Expresión de proteínas de adhesión. Se produce la translocación a la superficie de diversas proteínas de adhesión presentes en los gránulos alfa plaquetarios (P-selectina, GPIIb/IIIa, FvW, tromboespondina, fibrinógeno, fibronectina y vitronectina) que amplifican y perpetúan el proceso de adhesión plaquetaria y causan la interacción plaquetaria con células blancas.

- Exposición de una superficie plaquetaria procoagulante. Se produce un cambio drástico de la morfología (membrana) de las plaquetas, de un disco liso a una esfera espinosa, hecho que favorece la exposición en la membrana externa de componentes fosfolipoproteínicos ricos en fosfatidilserina. Ésta facilita la unión y la activación de los factores de la coagulación y la formación de trombina (potente agonista plaquetario)¹⁰¹, que amplifica el efecto activador inicial del colágeno y la activación, la liberación y el reclutamiento de las plaquetas. Todo ello produce la formación de eicosanoides y la aparición de filamentos de fibrina, inicialmente en la porción exterior del trombo plaquetario, pero también en los intersticios entre las plaquetas adheridas. El enlace de la trombina a la fibrina o a la pared arterial enmascara receptores en la trombina para la antitrombina III, la heparina y el cofactor II, de modo que este trombo mural actúa como un potente estímulo trombogénico —dependiente de trombina y relativamente resistente a la heparina— que favorece el crecimiento del trombo¹⁰².

Independientemente del estímulo que produce la activación plaquetaria, ésta se regula en su vía final por la activación del receptor plaquetario de GPIIb/ IIIa. El receptor de la GPIIb/IIIa es la proteína más abundante en la superficie plaquetaria y está compuesto por dos unidades proteínicas (IIb y IIIa). La activación de este receptor supone un cambio conformacional en las dos subunidades, de modo que exponen el dominio de unión para diversos ligandos. El fibrinógeno (de origen plasmático o plaquetario) es la proteína que se une mayoritariamente al dominio de unión del receptor de GPIIb/ IIIa y su estructura dimérica permite su interacción con dos plaquetas simultáneamente, lo que favorece la agregación plaquetaria. Existen otros ligandos de la GPIIb/IIIa que también participan, aunque en menor grado, en la interacción entre plaquetas, como el FvW, la fibronectina, la vitronectina y el CD40 ligando¹⁰³.

En la fase final de la formación del trombo, el fibrinógeno se convierte a fibrina por la trombina, y esto conduce a la estabilización de la agregación plaquetaria⁷⁷. Además, se produce la activación de la vía de señalización de dentro afuera, lo que causa una amplificación de la señal inicial y más activación y reclutamiento plaquetarios. Esto forma una masa que se expande y continúa reclutando más plaquetas a medida que éstas alcanzan el microambiente protrombótico. También se produce el reclutamiento de otras células hemáticas; con frecuencia se encuentran eritrocitos, neutrófilos y, algunas veces, monocitos que llegan intactos a la zona de la lesión, pero responden a la presencia de los componentes de secreción de la plaqueta.

ACTIVACIÓN DE LA CASCADA DE COAGULACIÓN

Uno de los eventos tempranos tras la rotura vascular es la activación de la cascada de la coagulación (fig. 8). Múltiples evidencias científicas sustentan un papel fundamental para el FT como potente agente inductor de la cascada de la coagulación; en particular, el FT expresado en células espumosas presentes en el núcleo lipídico de las lesiones ateroscleróticas^104-107. Además del FT, tanto las plaquetas activadas como el endotelio disfuncional tienen importante papel trombogénico promoviendo la cascada de la coagulación, con la consiguiente formación de fibrina. De hecho, el endotelio disfuncional cambia su fenotipo anticoagulante a uno procoagulante¹⁰⁸ a la vez que las plaquetas exponen en su superficie cofactores que permiten catalizar la formación de trombina a partir de protrombina, el resultado final de la activación de la cascada de la coagulación y la consiguiente formación de trombina, un potente agonista plaquetario e importante componente en la patogenia del proceso aterotrombótico. La señalización de trombina se produce a través de los cuatro receptores activadores de proteinasas¹⁰⁹ presentes en la superficie de diversos tipos celulares en las lesiones ateroscleróticas. Concretamente, PAR1 y PAR2 están presentes en las CML y favorecen su proliferación; PAR1, PAR2 y PAR4 están presentes en los macrófagos e inducen las vías de inflamación, y PAR1 y PAR4 están presentes en las plaquetas humanas y su señalización culmina en la activación del receptor del fibrinógeno. Por ello, la trombina, a través de los PAR, influye en una gran variedad de respuestas que favorecen el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas¹¹⁰. La activación de estos receptores se lleva a cabo mediante un proceso proteinolítico, a saber, la unión de la trombina con PAR produce una escisión del segmento aminoterminal del receptor que genera nuevas cadenas aminoacídicas terminales (SFLLRN para PAR1 y GYPGKF para PAR4), que después estimulan otras regiones del receptor¹¹¹.

Fig. 8. Esquema de los componentes plaquetarios involucrados en la cascada de la coagulación y en el proceso aterosclerótico. ADP: adenosindifosfato; bFGF: factor de crecimiento de fibrobastos; EGF: factor de crecimiento endotelial; ENA: péptido activador de células epiteliales derivado de neutrófilos; FvW: factor de von Willebrand; GP: glucoproteínas; IGF: factor insulinoide de crecimiento; IL: interleucina; MIP-1: proteína de inflamación derivada de macrófagos; PAI-1: inhibidor del plasminógeno tipo 1 activado; PDGF: factor de crecimiento derivado de plaquetas; PECAM: molécula de adhesión del endotelio celular y plaquetario; PF4: factor plaquetario 4; TGFβ: factor beta de crecimiento transformador; VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular.

En resumen, el receptor del fibrinógeno no sólo se activa a través de los receptores endoteliales o del colágeno GPIb/IX/V y GPVI, sino también de receptores acoplados a proteínas G tales como la trombina (PAR1, PAR4) o los receptores del ADP (P2Y₁, P2Y₁₂), los cuales potencian la agregación plaquetaria dependiente de la GPIIb/IIIa, así como la consiguiente formación de trombo.

MICROPARTÍCULAS DERIVADAS DE PLAQUETAS (MPp)

Múltiples evidencias en los últimos años indican que el papel de las plaquetas en la aterosclerosis y sus complicaciones trombóticas pueden estar mediadas, en parte, por la secreción de MPp (microvesículas plaquetarias formadas durante el proceso de activación plaquetaria)^112,113.

Se han descrito elevadas concentraciones de MPp circulantes en pacientes con aterosclerosis, síndromes vasculares agudos y/o diabetes mellitus¹¹², lo que indicaría correlación entre la cantidad de micropartículas (MP) y la severidad clínica de la enfermedad aterosclerótica¹¹⁴.

Aunque en la sangre se encuentran MP formadas a partir de diferentes tipos celulares (leucocitos, eritrocitos y células vasculares endoteliales y de músculo liso), el mayor número de MP circulantes es de origen plaquetario. Las MP presentan una carga proteínica derivada de la célula madre de la que provienen, contienen proteínas tanto de la membrana plasmática como de la zona citoplásmica situada en la vecindad de la parte de la célula donde se formaron. Así, las MPp presentan en su superficie una multitud de receptores de adhesión plaquetaria y quimiocinas (tales como P-selectina, GPIIb/IIIa y GPIbα, entre otros), los cuales no sólo inducen la producción de citocinas por los monocitos circulantes y el endotelio¹¹⁵, sino también un aumento en la agregación y el reclutamiento de leucocitos a través de interacciones dependientes de P-selectina y su ligando PSGL-1¹¹⁶. Del mismo modo, las MPp pueden adherirse al endotelio activado, potenciar así la adhesión de leucocitos mediante un incremento en la expresión de la molécula de adhesión ICAM-1¹¹⁷ y aumentar el ambiente inflamatorio por la producción de interleucinas (IL-1, IL-6 e IL-8)¹¹⁸. Es más, se ha señalado que las MPp circulantes podrían servir como módulos de transferencia celular de diversos mediadores proinflamatorios y receptores plaquetarios¹¹⁹. De ahí que altas concentraciones de MPp no reflejen exclusivamente un epifenómeno de activación plaquetaria, sino también se debe considerar que son un sistema de transporte y liberación transcelular. Las MPp generadas ex vivo causan contracción vascular in vivo, ya que inducen una concentración local elevada de TXA₂ en una arteria120. Aunque actualmente las MP circulantes tienen un reducido potencial pronóstico, los resultados disponibles hasta ahora indican que la caracterización de su origen y su composición proteínica puede ser una herramienta valiosa para determinar el riesgo cardiovascular incluso en pacientes sin manifestaciones clínicas.

TRATAMIENTOS HIPOLIPEMIANTES Y RIESGO DE TROMBOSIS

Diversos ensayos clínicos han demostrado la importancia de la reducción del colesterol de las LDL mediante la administración de inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (estatinas) para la prevención primaria y secundaria de las enfermedades cardiovasculares^121,122, efecto que se extiende a los pacientes con hipercolesterolemia familiar heterocigótica^121-123. Los resultados obtenidos en el ensayo clínico ASTEROID (A Study to Evaluate the Effect of Rosuvastatin on Intravascular Ultrasound-Derived Coronary Atheroma Burden)¹²⁴ han puesto de manifiesto, mediante análisis por ecografía intravascular (IVUS), que un tratamiento hipolipemiante agresivo es capaz de hacer que remita la placa aterosclerótica coronaria ya establecida. Es más, actualmente, se está llevando a cabo un estudio multicéntrico¹²⁵ que permitirá, mediante IVUS combinada con histología virtual, evaluar si dicha regresión también se asocia a cambios en su composición y una mayor estabilidad de la placa de ateroma. A pesar de todo ello, algunos ensayos clínicos muestran que los beneficios derivados del tratamiento con estatinas son en gran medida independientes de la reducción basal de colesterol de las LDL, lo que plantea la posibilidad de efectos clínicamente beneficiosos más allá de la reducción del colesterol de las LDL¹²⁶. De hecho, se ha demostrado que las estatinas tienen propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y antitrombóticas^127-130. En ese contexto, hemos demostrado que la cantidad de colesterol regula la reactividad plaquetaria¹³⁰. Es más, estudios preliminares realizados en pacientes hipercolesterolémicos con enfermedad coronaria estable han mostrado que el tratamiento con pravastatina se asocia a una marcada reducción en la formación del trombo y mejora del perfil fibrinolítico¹³¹. En este mismo contexto, hemos demostrado en pacientes con hipercolesterolemia familiar una notable y persistente mejoría de la función endotelial tras el tratamiento con simvastatina¹³². Los mecanismos que subyacen a estos efectos tromboprotectores quedan aún por dilucidar, aunque hemos realizado estudios in vitro¹³⁰ e in vivo^133,134 que vinculan una menor reactividad plaquetaria con una reducción en la activación de RhoA (una pequeña proteína de la familia de las Rho GTPasas involucrada en la reorganización del citoesqueleto plaquetario), así como con una menor expresión del FT en la pared vascular^133,134. La relevancia de la inhibición de la HMGCoA reductasa para la normalización y la estabilización del sistema cardiovascular queda reflejada en dos recientes contribuciones científicas. Por una parte, se ha demostrado que la administración de rosuvastatina tras la reperfusión de corazón isquémico, en un modelo experimental muy parecido a los humanos, induce menor lesión en el miocardio y mejoría en su capacidad de contracción¹³⁵. En el estudio Efficacy of Atorvastatin Reload in Patients on Chronic Statin Therapy Undergoing Percutaneous Coronary Intervention (ARMYDA-RECAPTURE), se ha demostrado que una dosis de carga de atorvastatina antes de la revascularización coronaria (80 mg 12 h antes seguida de 40 mg en el inicio del procedimiento) en pacientes ya tratados con estatinas mejora los eventos clínicos resultantes¹³⁶.

Bibliografía