INTRODUCCIÓN
La enfermedad coronaria (EC) continúa siendo la causa principal de mortalidad y morbilidad en los países industrializados1. El paradigma protector de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) ha sido ampliado, entre otros, debido a sus propiedades antioxidantes2,3. La principal enzima antioxidante transportada por las partículas de HDL es la paraoxonasa 1 (PON1). La PON1 es miembro de una familia de proteínas que incluye también a la PON2 y la PON34. La PON1 y la PON3 forman parte de las partículas de HDL, mientras que la PON2 se encuentra en una gran variedad de tejidos, como las células endoteliales, las células musculares lisas y los macrófagos. El mecanismo de acción de la familia de la PON aún está poco claro. La PON1 tiene una actividad esterasa hacia varios sustratos, mientras que la PON2 y la PON3 muestran una elevada actividad lactonasa5,6. Se han propuesto, además, otras acciones biológicas de las enzimas PON: la fosfolipasa A2, que hidroliza el factor de activación de las plaquetas y la oxidación de los lípidos, y la participación en la hidrólisis e inactivación de la tiolactona. No obstante, el mecanismo principal de protección ligado a la PON1 transportada por el HDL parece ser el transporte inverso del colesterol y la prevención de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL)6. Por otro lado, se ha observado una propiedad antioxidante de las PON2 similar a la de la PON1 en la prevención de la oxidación de las LDL7. Varios estudios han centrado su interés en la sustitución del aminoácido de la posición 311 (serina→cisteína) en el gen PON28 y el de la posición 192 (glutamina→arginina) en el gen PON19 y su potencial efecto en la actividad de estas enzimas y en la susceptibilidad individual del riesgo de EC.
La relación entre los polimorfismos PON1-192 y PON2-311 y el riesgo de EC no está bien establecida. Los resultados de los estudios previos son contradictorios2,10,11. Aunque 3 metaanálisis han concluido que el alelo R del polimorfismo PON1-192 tiene relación, débil pero significativa, con incremento del riesgo de EC, otros estudios llevados a cabo en Europa12-14, Estados Unidos15 y Japón16 mostraron una tendencia aumentada de EC en los individuos con genotipo QQ. Además, pocos estudios han evaluado la relación entre las variantes genéticas de la PON2 y la EC. Algunos trabajos, aunque no todos, mostraron que el alelo S del polimorfismo PON2-311 estaba directamente relacionado con la EC, la demencia vascular y el infarto cerebral o las complicaciones microvasculares tempranas en los pacientes diabéticos17,18. Pocos estudios han analizado el riesgo de EC atribuido a las variantes genéticas de la PON1 y la PON2 simultáneamente18-22.
El objetivo del presente estudio es determinar la relación entre los polimorfismos PON1-192 y PON2-311 y su interacción con el infarto agudo de miocardio (IAM).
MÉTODOS
Diseño del estudio
Estudio de casos y controles de base poblacional, que incluye 4 regiones de España: Castilla-La Mancha, Girona, Mallorca y el País Vasco. Se han usado métodos idénticos para detectar los acontecimientos de IAM, para registrar las características demográficas y clínicas y para las determinaciones de laboratorio, que fueron centralizadas. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos; el comité ético local aprobó el estudio, que sigue la declaración de Helsinki.
Identificación de los casos
Para este estudio, se reclutó prospectivamente a 746 pacientes consecutivos (620 varones y 126 mujeres; media de edad, 60,0 ± 10,3 años) que habían sobrevivido a un primer IAM y habían sido admitidos a las unidades coronarias de referencia de las áreas de estudio entre los años 1999 y 2000. En este estudio se usaron los criterios de diagnóstico de IAM y definiciones estándar23. Todos los sujetos eran caucásicos y con antepasados europeos.
Selección de los controles
Usando los datos del Censo Nacional, se seleccionó de forma aleatoria una muestra poblacional de 1.796 sujetos controles libres de enfermedad cardiovascular (1.508 varones y 288 mujeres; media de edad, 59,3 ± 10,4 años) de la población de la misma región de donde se habían recogido los casos y en el mismo período. La tasa de participación fue superior al 70%. La angina y el IAM se definieron a través de la historia clínica y el electrocardiograma. Se excluyó del estudio a los sujetos con enfermedad cerebrovascular, enfermedades no cardiovasculares de mal pronóstico a corto plazo, discapacidad mental o abuso de drogas.
Tamaño de muestra y poder estadístico
El poder estadístico es del 90% para detectar como estadísticamente significativa una odds ratio (OR) ≥ 1,35, aceptando un riesgo alfa de 0,05 en un contraste bilateral y definiendo un modelo genético dominante, con una prevalencia del genotipo homocigoto común del 60% en los controles, y una proporción entre controles y casos = 2,4.
Análisis de laboratorio
En los controles, las muestras de sangre fueron recogidas después de una noche en ayunas. En los casos de IAM, se obtuvo una muestra de sangre para aislar el ADN en las primeras horas posteriores a la llegada al hospital, y una segunda muestra biológica para obtener plasma y suero a los 6 meses después del acontecimiento coronario agudo de los que sobrevivieron a la fase aguda.
Todos los análisis se realizaron en un laboratorio centralizado. Los valores séricos de glucosa, colesterol total y triglicéridos se determinaron usando kits enzimáticos (Roche Diagnostic, Basilea, Suiza) adaptados a un autoanalizador Cobas Mira Plus (Hoffmann-La Roche, Basilea, Suiza). El colesterol de las HDL (cHDL) se determinó como el colesterol después de la precipitación de las lipoproteínas que contienen la apolipoproteína B con fosfotungstato-Mg++ (Boehringer Mannheim, Alemania). El colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (cLDL) se calculó con la fórmula de Friedewald24.
Genotipificación
Se aisló el ADN genómico de las células blancas con el método de salting-out25. Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para genotipificar el polimorfismo PON1-192 (rs662 en dbSNP) usando las secuencias derivadas de datos publicados26. El ciclo de amplificación para genotipificar el polimorfismo PON1-192 se llevó a cabo en un termociclador Perkin-Elmer Cetus 2400 con una desnaturalización inicial de 4 min a 94 °C, seguida por 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 1 min a 61 °C y 1 min a 72 °C, con una extensión final de 7 min a 72 °C. Después de la amplificación, los productos de la PCR se digerían con AlwI (4 h a 37 °C) y se separaban por electroforesis en un gel de agarosa al 3% a 60 V durante 75 min. Para genotipificar el polimorfismo PON2-311 (rs7493 en dbSNP) se usó la PCR cuantitativa a tiempo real con una sonda TaqMan Assay-on-Demand (C___8952817_10, Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos).
Otras variables
La hipertensión se definió de acuerdo con la historia de hipertensión referida por el paciente. La diabetes fue definida como la glucosa en ayunas ≥ 126 mg/dl o el uso de insulina o medicación hipoglucémica. Se clasificó a los sujetos como fumadores actuales si declaraban haber fumado cigarrillos durante el año previo. Se midieron el peso y la altura con el individuo descalzo y con poca ropa en una balanza y un tallímetro calibrados. El índice de masa corporal se calculó como el peso en kilogramos dividido por el cuadrado de la estatura en metros. También se registró el uso de fármacos para el tratamiento de la dislipemia. Se calculó el gasto energético diario en actividad física en el tiempo libre durante el año previo con el Cuestionario de Actividad Física en el Tiempo Libre de Minnesota, que está validado para su uso en población española27,28 y se aplicó durante la estancia hospitalaria.
Análisis estadístico
Debido a la baja prevalencia de homocigotos RR (11%) y CC (5%) en los genotipos de PON1-192 y PON2-311, respectivamente, se definió un modelo genético dominante. La diferencias en variables continuas entre los dos grupos de genotipos de PON1-192 (como QQ respecto a portadores de R) o entre los dos grupos de genotipos de PON2-311 (como SS respecto a portadores de C) y entre los pacientes con IAM y los controles se analizaron con la prueba de la t de Student o la U de Mann-Whitney, y con la prueba de la χ2 para las variables categóricas.
La odds ratio (OR) del IAM ajustada por las variables de confusión para los genotipos de PON1-192 y PON2-311 se estimó con el análisis de la regresión logística condicional.
Se analizó la tendencia lineal con la prueba de la χ2 para variables categóricas, y el ANOVA para las variables continuas estratificadas por los genotipos de PON1-192 y PON2-311. El análisis del desequilibrio de ligamiento entre las dos variantes genéticas se realizó en el lenguaje estadístico R 2.1.1 con el paquete haplo.stats de R. Los demás análisis se realizaron usando SAS versión 8,2 (SAS Institute, Cary, N.C., Estados Unidos). Se consideró como estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
RESULTADOS
La frecuencia del alelo R de PON1-192 fue 0,32 en los controles y 0,29 en los casos y la frecuencia del alelo C de PON2-311, 0,21 en los controles y 0,19 en los casos. La proporción de diabetes, hipertensión y tabaquismo fue mayor en los casos que en los controles, y el gasto energético en actividad física en el tiempo libre fue menor (tabla 1). Seis meses después del acontecimiento, el índice de masa corporal y las concentraciones del colesterol total, cLDL y cHDL fueron significativamente menores y las de triglicéridos, mayores en pacientes con IAM que en los controles. La proporción de pacientes con tratamiento dislipémico fue mucho mayor entre los pacientes con IAM que en los controles. No se detectó desequilibrio de ligamiento entre los dos polimorfismos (D' = 0,083). Los genotipos QQ y SS se observaron con mayor frecuencia en los pacientes con IAM (tabla 1).
Los sujetos portadores del alelo R en el polimorfismo PON1-192 presentaban una menor proporción de casos de IAM, un mayor porcentaje de mujeres, mayores concentraciones de cHDL y menores cifras de triglicéridos que los homocigotos QQ (tabla 2). Los sujetos portadores del alelo C en el polimorfismo PON2-311 tenían una menor proporción de casos de IAM.
La OR bruta de presentar un IAM para el genotipo QQ del PON1-192 era 1,21 (intervalo de confianza [IC] del 95%, 1,02-1,44). Después de ajustar por cHDL y triglicéridos, la OR era 1,26 (IC del 95%, 1,02-1,55). La OR bruta de presentar un IAM para el genotipo SS del PON2-311 era 1,25 (IC del 95%, 1,04-1,49). Después de ajustar por edad y sexo, OR = 1,25 (IC del 95%, 1,04-1,5).Ninguna de las interacciones de primer orden entre los polimorfismos PON1-192 o PON2-311 y diabetes, hipertensión, tabaquismo, índice de masa corporal, cHDL y gasto energético en actividad física en el tiempo libre respecto al riesgo de IAM fue estadísticamente significativa. La OR bruta para el IAM de individuos portadores de ambos genotipos QQ y SS era 1,38 (IC del 95%, 1,16-1,65). Después de ajustar por cHDL y triglicéridos, OR = 1,41 (IC del 95%, 1,13-1,76).
DISCUSIÓN
En este estudio de casos y controles realizado en una muestra grande y representativa de la población española, hemos observado que los polimorfismos PON1-192 y PON2-311 están asociados de manera independiente con el riesgo de presentar un IAM en nuestra población.
Estudios previos ya han analizado el papel de los polimorfismos PON1-192 y PON2-311 en el riesgo de EC. Tres metaanálisis recientes concluyeron que el alelo R del polimorfismo PON1-192 tiene relación, débil pero significativa, con un aumento de riego de EC, a pesar de que muchos de los estudios incluidos en estos tres metaanálisis no alcanzaban significación estadística2,10,11. Además, algunos de estos estudios incluidos en los metaanálisis mostraban una tendencia de asociación inversa, de modo que el genotipo QQ se asociaba con un mayor riesgo de EC12-16. Los resultados de nuestro estudio también indican que el genotipo QQ del polimorfismo PON1-192 se asocia con una mayor susceptibilidad de presentar IAM. Hay varias razones que pueden explicar las diferencias entre nuestro estudio y las conclusiones de los metaanálisis. Los metaanálisis pueden estar afectados por varios sesgos, entre ellos el sesgo de publicación y la heterogeneidad entre los estudios que pueden limitar la validez de los resultados. Por otro lado, debemos tener en cuenta también otros posibles sesgos de selección, reclutamiento de poblaciones con diferentes etnias y diferencias en el criterio utilizado para las definiciones del fenotipo de interés entre los estudios. Aunque también hay discrepancias en lo que concierne a la asociación entre el polimorfismo PON2-311 y la EC, la mayoría de los estudios muestran un incremento del riesgo de EC en los portadores del alelo S17,18. El presente estudio se basa en una muestra grande y representativa de diversas regiones de un país étnicamente homogéneo, con protocolos de reclutamiento idénticos para cada región, y con controles representativos de la población de la que provienen los casos.
En el presente estudio, se ha analizado ambos genotipos en la misma muestra. Pocos estudios hasta la fecha han considerado los dos genotipos para estimar el riesgo de EC18-22. Dos de ellos18,19 identificaron el alelo R del polimorfismo PON1-192 como de elevado riesgo de EC en portadores del alelo C o S del polimorfismo PON2-311 en población caucásica o de la India, respectivamente. Otro estudio20 encontró una interacción entre el alelo C del polimorfismo PON2-311 y el consumo de tabaco asociado al riesgo de IAM, mientras que otro trabajo21 no alcanzó significación estadística, probablemente debido a un modesto tamaño muestral. En el presente estudio, en nuestra población caucásica, los sujetos homocigotos por ambos alelos Q y S mostraron un riesgo incrementado de IAM al compararlos con los homocigotos de uno sólo de los polimorfismos. Se ha propuesto que el alelo S del polimorfismo PON2-311 podría actuar sinérgicamente con los polimorfismos de la PON1, independientemente de otros factores de riesgo clásicos18,29.
El papel antioxidante de la PON1 ha sido evaluado en estudios in vitro, y se ha demostrado su capacidad para prevenir la oxidación de las LDL, destruir los lipoperóxidos y promover el transporte inverso de colesterol de los macrófagos, pasos implicados en el desarrollo de la arteriosclerosis4. Estudios in vivo en animales han demostrado un mayor desarrollo de la arteriosclerosis en ratones knock-out para el gen PON130. En humanos, aún se está debatiendo si el alelo Q del polimorfismo PON1-192 determina una mayor capacidad enzimática antioxidante que el alelo R31,32.
La enzima PON2 --que se expresa, entre otros tejidos, en el endotelio humano y en las células musculares lisas aórticas-- reduce la partícula de LDL oxidada cuando esta enzima se sobreexpresa en el interior celular6. Además, la expresión de la PON2 en los macrófagos aumenta en condiciones de estrés oxidativo33. De esta manera, se ha señalado que la PON2 puede actuar como una respuesta antioxidante selectiva a escala celular y puede tener efecto antiaterogénico atenuando la formación de células espumosas y reduciendo el estrés oxidativo7.
Aún se desconoce qué alelos de los genes PON1 y PON2 son los que tienen mayor actividad para el sustrato fisiológico in vivo. Determinar esta cuestión es relevante para poder conocer los mecanismos que expliquen la relación entre los polimorfismos PON1 y PON2 y el riesgo de IAM.
Limitaciones
Una limitación de nuestro estudio es que sólo se reclutó a pacientes de IAM que llegaron al hospital vivos; por lo tanto, se debe tener en cuenta un posible sesgo de supervivencia. No obstante, esta limitación es inherente a todos los estudios con diseño de casos y controles. Otra limitación es que sólo estuvieron disponibles las determinaciones biológicas en suero de los pacientes que sobrevivieron al menos 6 meses desde la fecha del acontecimiento. Por otra parte, las demás variables de interés fueron recogidas cuando los pacientes estaban en el hospital.
La magnitud de las asociaciones presentadas en este estudio, aunque son estadísticamente significativas, son menores que las que corresponden a los factores de riesgo clásicos, como el consumo de tabaco, la diabetes, la hipertensión o el colesterol. Estos resultados son los que esperábamos en el contexto de una enfermedad compleja como es el IAM, donde múltiples genes y variantes genéticas pueden participar.
Por otro lado, este estudio podría tener algunas implicaciones clínicas: en primer lugar, nuestro estudio respalda el papel de la paraoxonasa en la patogenia de la aterosclerosis; en segundo lugar, confirmamos la asociación entre dos polimorfismos de los genes PON1 y PON2 como factores de riesgo independientes de IAM en nuestra población, y estos dos marcadores podrían utilizarse para identificar a los individuos con mayor riesgo de padecer IAM; y, finalmente, nuestro resultados sostienen una nueva potencial diana terapéutica. Se precisan más estudios con la finalidad de identificar las variantes genéticas causales.
CONCLUSIONES
Nuestros resultados indican que los polimorfismos PON1-192 y PON2-311 son factores de riesgo independientes de IAM en nuestra población.
Full English text available from: www.revespcardiol.org
ABREVIATURAS
EC: enfermedad coronaria.
HDL: lipoproteína de alta densidad.
IAM: infarto agudo de miocardio.
IC: intervalo de confianza.
LDL: lipoproteína de baja densidad.
OR: odds ratio.
PON1: paraoxonasa 1.
PON2: paraoxonasa 2.
La lista completa de los investigadores del estudio IBERICA está disponible en: http://www.regicor.org/inv_IBERICA_CC
Mònica Guxens y Marta Tomás han contribuido por igual a la realización de este trabajo.
Este estudio ha sido financiado por una subvención de AstraZéneca, subvenciones del Fondo de Investigación Sanitaria # FIS 96/0026-01 hasta 05, FIS 97/1270, FIS 98/1535, FIS C03/09, FIS C03/045, por la administración sanitaria de las siguientes comunidades autónomas españolas: Mallorca, Castilla-La Mancha, Cataluña (CIRIT/2001 SGR 00408) y País Vasco, por el CIBER Epidemiología y Salud Pública (CIBERESP) y la Red HERACLES.
Correspondencia: Dr. J. Marrugat.
Unitat de Lípids i Epidemiologia Cardiovascular. Institut Municipal d'Investigació Mèdica (IMIM).
Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona (PRBB).
Dr. Aiguader, 88. 08003 Barcelona. España.
Correo electrónico: jmarrugat@imim.es
Recibido el 28 de marzo de 2007.
Aceptado para su publicación el 9 de octubre de 2007.
