Entre 2008 y 2013 se incluyeron prospectivamente 155 casos de MSC debida a EC (MSC-EC, pacientes) y 84 de muerte súbita (MS) inesperada no debida a una EC (MS-no-EC, controles) con pruebas de toxicología negativas. La definición de la MS se atuvo a lo establecido en las recomendaciones internacionales1. En las autopsias de MSC por EC, se identificó como mínimo 1 estenosis coronaria significativa (> 75%) o placas complicadas (con erosión, rotura, trombosis o hemorragia intraplaca) o signos histológicos agudos o ya cicatrizados de infartos de miocardio27. Los controles con MS-no-EC fueron 38 casos de MS no cardiaca y 46 de MSC no isquémica (miocarditis y miocardiopatías primarias). La información clínica premortem, las circunstancias de la muerte, los datos de la autopsia como el índice de masa corporal, el perímetro abdominal, exploración cardiaca y hepática y los análisis toxicológicos ordinarios se atuvieron a lo establecido en la vigente guía27.

El protocolo del estudio cumplió las normas éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 y fue aprobado por el comité de investigación humana del centro. Los pacientes y los controles habían fallecido en el momento de la inclusión en el estudio y todas las muestras biológicas analizadas se habían obtenido en la autopsia forense exigida por la legislación española en casos de MS inesperada fuera del hospital. Por consiguiente, no se obtuvo un consentimiento informado por escrito.

Siempre que fue posible, se determinaron los parámetros analíticos en sangre periférica obtenida post mortem. Las concentraciones de colesterol total, triglicéridos y GGT se determinaron con métodos enzimáticos y el colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad, con métodos directos (Architect 16000, Abbott Diagnostic). Cuando los triglicéridos eran < 300 mg/dl, el colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad se calculó con la fórmula de Friedewald. El colesterol unido a lipoproteínas de muy baja densidad se obtuvo a partir de triglicéridos / 5. Los valores de lipoproteína(a) y apolipoproteínas A y B se determinaron por nefelometría cinética (Immage Nephelometer, Beckman Coulter Inc.; Brea, California, Estados Unidos) y la proteína C reactiva de alta sensibilidad se determinó con métodos de turbidimetría cinética (Immage Nephelometer).

Durante el examen macroscópico del corazón, se realizaron cortes transversales cada 0,5cm, empezando en el ápex cardiaco, siempre en paralelo a los surcos auriculoventriculares, con objeto de registrar el grosor máximo de la GE en cada lugar (figura 1 del material suplementario). Se designó como puntuación de GE la suma total de los grosores de la GE de cada individuo, y se consideró que ello constituía una estimación de la cantidad total de GE presente en el corazón.

Se obtuvieron muestras de GE de los pacientes, principalmente de las arterias coronarias con una estenosis significativa, algunas de la proximidad de placas complicadas y algunas de arterias coronarias sin estenosis, mientras que las muestras de GE de los controles procedieron siempre de arterias coronarias sin estenosis. Las muestras se lavaron de inmediato con solución salina tamponada con fosfato fría, con objeto de eliminar la contaminación de sangre, y se conservaron luego en ARN (Ambion; Austin, Texas, Estados Unidos) a –20°C hasta el momento de su estudio. Se obtuvieron muestras de hígado en fresco y se procesaron según lo descrito anteriormente15.

Se extrajo el ARN total de la GE con el kit de aislamiento de miARN mirVana-Paris (Ambion), según el protocolo del fabricante. La concentración de ARN y su pureza se determinaron con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Nanodrop Technologies; Wilmington, Delaware, Estados Unidos). La calidad del ARN para los array de expresión de miARN se evaluó con el Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies; Santa Clara, California, Estados Unidos).

El ARN para los análisis de microarray incluyó 3 muestras de GE de los controles (concretamente, 1 muestra de la GE próxima a la arteria descendente anterior izquierda sana de cada control) y 3 muestras de GE de los pacientes (de arterias coronarias con una estenosis estable significativa, en concreto 2 de la arteria descendente anterior izquierda y 1 de la arteria coronaria derecha). Los análisis se realizaron en el Servicio de Array del centro (Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, Valencia, España) con el Array GeneChip miRNA 3.0 (Affymetrix; Santa Clara, California, Estados Unidos), que contiene sondas de 1.733 miARN humanos maduros (miRBase versión 17).

Los datos se analizaron con el software PARTEK Genomic Suite (PARTEK; St. Louis, Missouri, Estados Unidos) y se normalizó mediante un algoritmo Robust Multiarray Analysis. Se obtuvo una lista de los miARN con diferencias significativas (cambio de ± 1,5 veces; p < 0,05) entre los pacientes y los controles. Las herramientas bioinformáticas (mirbase.org, microrna.org, targetscan.org y herramientas Diana) permitieron elegir 7 miARN de entre los que tenían una expresión diferente, cuyas dianas intervenían en la ateroesclerosis, el metabolismo lipídico o la fisiopatología adipocitaria: miR-34a-3p, -34a-5p, -124-3p, -125a-5p, -628-5p, -1303 y -4286.

Los miARN seleccionados se validaron en 28 muestras de GE de 28 controles y en 186 muestras de GE de 99 pacientes (se obtuvo 1 muestra de GE procedente de una arteria coronaria con estenosis estable significativa en 78 pacientes, 1 muestra de GE procedente de una placa complicada en los 21 pacientes restantes y, por último, 1 muestra de GE de una arteria coronaria sin placas de ateroesclerosis en 87 de los pacientes anteriormente mencionados). Dado que las cantidades de ARN pequeño nuclear RNU6B fueron muy variables en el presente análisis de reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real, se eligió en su lugar el miARN-363-3p como control endógeno, con una expresión estable en los arrays y en las cuantificaciones mediante reacción en cadena de polimerasa en tiempo real. Se cuantificó el miR-34a-5p hepático en muestras de hígado procedentes de 23 controles y 62 pacientes de los que se habían obtenido también muestras de GE emparejadas (se obtuvo 1 muestra de GE procedente de una arteria coronaria sin estenosis significativa de cada uno de los 23 controles, 1 muestra de GE procedente de una arteria coronaria con una estenosis estable significativa de 54 pacientes, 1 muestra de GE procedente de una placa complicada de los 8 pacientes restantes y, por último, 1 muestra de GE de una arteria coronaria sin placas de ateroesclerosis de 55 de los pacientes anteriormente mencionados).

Las determinaciones de la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real se realizaron mediante la PCR de microARN RT miRCURY LNA Universal (Exiqon; Vedbaek, Dinamarca) y un instrumento Light Cycler 480 II (Roche Applied Science; Penzberg, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las variables cualitativas se expresan en forma de porcentajes y se compararon con la prueba de la χ2. Dependiendo de la normalidad de la prueba, las variables continuas se expresan en forma de media ± desviación estándar, media ± error estándar de la media o mediana [intervalo intercuartílico] y se compararon con la prueba de la t de Student, un ANOVA o la prueba de la U de Mann-Whitney, según procediera. La cuantificación de los miARN se presenta en forma de múltiplos de cambio relativo respecto a los resultados obtenidos en la GE de las arterias coronarias sanas de los controles. Las correlaciones se determinaron con la prueba de la ro de Spearman o el coeficiente de correlación de Pearson, según procediera. Para evaluar los resultados obtenidos con los clasificadores, se elaboraron las curvas de características operativas del receptor. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa Statistical Package for the Social Sciences versión 20.0 for Windows (SPSS Inc.; Chicago, Illinois, Estados Unidos).

No se observaron diferencias significativas en los intervalos post mortem. En la tabla 1 se presentan las características generales de los pacientes y los controles. En comparación con los controles, los pacientes eran de más edad, principalmente varones y mostraban unos valores superiores de los parámetros antropométricos, el colesterol total y la proteína C reactiva de alta sensibilidad. Se observaron placas ateroescleróticas complicadas en un 34% de los pacientes y su presencia se asoció solo con la edad (pacientes con y sin placas complicadas, 46,2 ± 8,4 frente a 48,6 ± 6,1 años; p = 0,002).

Los pacientes presentaron en diferentes localizaciones mayor grosor de la GE que los controles (tabla 1). Tras un ajuste en un modelo multivariable teniendo en cuenta la edad, el sexo, el índice de masa corporal y el perímetro abdominal, solo el grosor de la GE en el surco auriculoventricular izquierdo y el surco interventricular anterior siguieron mostrando un aumento significativo. El grosor máximo de la GE se observó en los surcos auriculoventriculares en ambos grupos.

Se observó una correlación significativa del grosor de la GE en cada localización con la puntuación de GE total (figura 2 del material suplementario). En diferentes lugares del ventrículo derecho y de los surcos auriculoventriculares, el grosor de la GE mostró con frecuencia una leve correlación positiva con la edad, el índice de masa corporal y el perímetro abdominal, que fue rara en el caso de la GE en localizaciones del ventrículo izquierdo (tabla 2).

Los valores de grosor de la GE permitían diferenciar bien a los pacientes de los controles (figura 1). La mejor área bajo la curva fue la observada para la puntuación de GE, seguida del surco auriculoventricular derecho y el surco interventricular anterior. Estos análisis mostraron alta sensibilidad, pero con baja especifidad para el punto de corte de 3,5mm, y se obtuvieron estimaciones opuestas para las paredes anterior, posterior y lateral del ventrículo izquierdo.

Figura 1.

Exactitud de las mediciones de la GE en cuanto a la predicción del estado en los pacientes con MSC-EC (n = 130) y los controles con MS-no-EC (n = 73). A: solo se muestran las AUC con los valores de p más estadísticamente significativos y su línea de referencia. B: se indican todas las AUC con la combinación más útil de sensibilidad y especificidad para cada medida de la GE (umbral, > 3,5 mm). AUC: área bajo la curva; AV: auriculoventricular; EC: enfermedad coronaria; GE: grasa epicárdica; IV: interventricular; MS: muerte súbita; MSC: muerte súbita cardiaca; puntuación de GE: suma total de las mediciones del grosor de la GE en cada individuo; VD: ventrículo derecho; VI: ventrículo izquierdo.

La significación estadística (p < 0,05) se evaluó con el método de la curva de características operativas del receptor.

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El perfil de expresión de miARN mostró agrupaciones separadas para los pacientes y los controles (figura 2A). Se observó una desregulación significativa en 28 miARN maduros: 14 con aumento y 14 con disminución en los pacientes (tabla 1 del material suplementario). Para validar estos resultados, se seleccionaron 7 miARN en función de sus posibles dianas (metabolismo lipídico, fisiopatología adipocitaria u otras vías relacionadas que intervienen en la ateroesclerosis y la desestabilización de la placa), a saber: miR-34a-3p, -34a-5p, -124-3p, -4286, -125a-5p, -628-5p y -1303 (figura 2B).

Figura 2.

Perfil de expresión de miARN en muestras de GE de 3 pacientes con MSC-EC y 3 controles con MS-no-EC. A: agrupación jerárquica no supervisada que muestra patrones de expresión de miARN diferentes (en rojo, de aumento de los miARN; en azul, de disminución de los miARN). B: gráfico de volcán en el que se muestra la magnitud de los cambios de los miARN con una expresión diferente (líneas sombreadas, cambio de ±1,5 veces; p < 0,05). EC: enfermedad coronaria; GE: grasa epicárdica; miARN: micro-ARN; MS: muerte súbita; MSC: muerte súbita cardiaca. La significación estadística (p < 0,05) se evaluó mediante un ANOVA. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

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Se observó mayor cantidad de miR-34a-3p y -5p en la GE de los pacientes que en la de los controles, con independencia de la presencia o ausencia de placas de ateroesclerosis en su proximidad (tabla 3). Al examinarlo específicamente en los pacientes, no se observaron diferencias en ninguno de los miARN analizados por lo que respecta a la presencia o ausencia de estenosis coronarias subyacentes. Sin embargo, se observó una tendencia a una mayor desregulación de los miR-34a-3p y -34a-5p en la GE adyacente a placas de ateroesclerosis complicadas (tabla 3). La exactitud en la predicción del grupo clínico (pacientes o controles) fue estadísticamente significativa para los miR-34a-3p y -34a-5p de la GE (figura 3).

Figura 3.

Exactitud de las determinaciones de miRNA-34a-3p y miRNA-34a-5p de la GE en cuanto a la predicción del estado de los pacientes con MSC-EC (n = 186) y los controles con MS-no-EC (n = 28). Se presentan las curvas ROC para los miARN con resultados estadísticamente significativos y sus líneas de referencia. AUC: área bajo la curva; EC: enfermedad coronaria; GE: grasa epicárdica; miARN: micro-ARN; MS: muerte súbita; MSC: muerte súbita cardiaca; ROC: características operativas del receptor. La significación estadística (p < 0,05) se evaluó con el método de ROC.

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Solo en el grupo de control hubo una correlación significativa de los miR-34a-3p y -34a-5p de la GE con la edad, y también una correlación de los miR-34a-3p, -34a-5p y -124-3p con la puntuación de GE y varias mediciones individuales del grosor de la GE (tabla 2 del material suplementario). No se observó ninguna otra correlación de posible relevancia (r > 0,5) y estadísticamente significativa en los controles ni en los pacientes.

Este grupo anteriormente describió un aumento de miR-34a-5p hepáticos en las víctimas de una MS con EC o EHGNA15, y en el presente estudio se determinó simultáneamente en extractos de hígado y de GE de controles y pacientes. Se observó una correlación leve y significativa entre la cantidad de miR-34a-5p en el hígado y en la GE próxima a la estenosis coronaria de los pacientes, que aumentaba notablemente en el subgrupo de muestras de GE procedentes de placas complicadas (figura 4A). Además, se exploró la relación de la proteína C reactiva de alta sensibilidad y el miR-34a-5p determinado en muestras de GE o de hígado procedentes de los mismos pacientes (figura 4B y C). Nuevamente, las correlaciones apenas significativas observadas en la GE adyacente a las placas de ateroesclerosis pasaron a ser más intensas al analizar solo la GE procedente de placas de ateroesclerosis complicadas. En cambio, no se observaron correlaciones significativas en la GE de las arterias coronarias sin estenosis de los mismos pacientes ni en la GE de los controles (datos no mostrados).

Figura 4.

Correlaciones entre cantidad de miR-34a-5p en muestras de GE y hepáticas y entre cada uno de ellos y la PCRas de los pacientes con MSC-EC (n = 78). La GE se obtuvo de arterias coronarias con EC. A: correlación entre los valores de miR-34a-5p en la GE y el hígado. B: correlación entre los valores de miR-34a-5p en la GE y la PCRas. C: correlación entre los valores de miR-34a-5p hepáticos y la PCRas. EC: enfermedad coronaria; GE: grasa epicárdica; MSC: muerte súbita cardiaca; PCRas: proteína C reactiva de alta sensibilidad. La significación estadística (p < 0,05) se evaluó mediante correlaciones de Pearson.

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