INTRODUCCIÓN

La integridad del endotelio es esencial para conservar la estructura y el funcionamiento normal de la pared vascular. La denudación endotelial estimula la trombogénesis, la activación leucocitaria y su posterior infiltración en la pared vascular, la proliferación de la célula del músculo liso (CMLV), su migración hacia la luz del vaso, y la síntesis de matriz extracelular. Todos estos fenómenos que ocurren también tras realizar una angioplastia con balón, y la implantación de un stent , pueden estar implicados en los mecanismos que desencadenan la reestenosis 1-4 .

El óxido nítrico (NO) es una molécula multifuncional que interfiere con los mecanismos anteriormente mencionados activados tras la denudación del endotelio. El NO inhibe la interacción de las plaquetas con la pared vascular, la activación leucocitaria, la proliferación de las CMLV y la síntesis de proteínas de matriz 5-8 .

El NO se produce mediante el paso de L-arginina a L-citrulina, mediante una serie de sintasas las cuales forman una familia denominada NO sintasas 9 . Hasta el momento se han identificado tres isoformas, que por el orden de su purificación y del aislamiento de su ADN se han denominado: NOS I, constitutiva de tejido neuronal (NOSn); NOS II, inducible por citocinas en macrófagos y CMLV (NOSi), y NOS III, constitutiva de células endoteliales (NOSe). En la pared vascular se expresan dos isoformas de NOS, la NOSe, que se expresa en condiciones normales en la célula endotelial y la NOSi, que no se expresa en condiciones fisiológicas en la pared y cuya expresión en las CMLV aumenta cuando se estimulan estas células con citocinas o endotoxinas 9 .

Joly et al demostraron que las arterias desendotelizadas presentaban una menor respuesta vasoconstrictora, y sugirieron que la denudación endotelial induce la actividad de la NOSi en la pared vascular 10 . Estudios in vitro, realizados en nuestro laboratorio, han demostrado que las células endoteliales disminuyen la expresión de NOSi en las CMLV 11 . Es interesante señalar que la expresión de la NOSi en las CMLV está altamente regulada. Muchos de los factores que regulan la mayor o menor expresión de la NOSi estimulada por citocinas son liberados por las plaquetas 12 .

Es interesante señalar que inmediatamente después de denudar el endotelio se activan las plaquetas. En el mecanismo de activación plaquetaria intervienen distintas familias de proteínas expresadas en la superficie plaquetaria. Entre estas proteínas destacan la familia de las integrinas, cuyo principal componente es la glicoproteína IIb/IIIa (GP IIb/IIIa). El complejo GP IIb/IIIa funciona como receptor del fibrinógeno, fibronectina, factor de Von Willebrand, vitronectina y trombospondina después de la activación de la plaqueta 13 . En la segunda parte de este trabajo se estudió el papel de las plaquetas en la expresión de la NOSi en la pared vascular tras denudación endotelial analizando la importancia de la GP IIb/IIIa, y de fármacos como el abciximab que bloquean esta glicoproteína.

Por tanto, teniendo en cuenta estos antecedentes, los objetivos de este estudio han sido: a) estudiar la expresión de la NOSi en un modelo de denudación endotelial in vivo, realizado en carótida de rata; b) analizar el papel de las plaquetas activadas en la expresión de la NOSi en la pared vascular, y c) analizar la importancia del uso de antiagregantes plaquetarios como el abciximab, en la expresión de la NOSi en la pared vascular tras la denudación del endotelio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Modelo de denudación endotelial in vivo

Se realizó un modelo de denudación endotelial estandarizada, y para ello se emplearon ratas Wistar macho de 300 ± 50 g (4-6 meses de edad). La manipulación de los animales se realizó siguiendo las normas aprobadas por el Comité de Investigación Animal de la Fundación Jiménez Díaz.

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo anestesia general mediante inyección intraperitoneal de ketamina (6 mg/100 mg de peso) y clorhidrato de 2-(2-6-xilidin)-5,6 dihidro-4-H-1,3 tiazina (23 mg/100 mg de peso). Se disecó la bifurcación interna y externa de la carótida izquierda, y se realizó una pequeña arteriotomía en la carótida externa, insertándose un catéter de balón 2F Fogarty (Baxter, EE.UU.).

El catéter se introdujo en la aorta, 2 cm detrás de la bifurcación de la carótida. A continuación se infló con 0,2 ml de aire, a 6 atmósferas, durante 60 s, y durante el tiempo que duró el inflado se manipuló el balón en sentido rotatorio axial y longitudinal, con el fin de obtener un área vascular de unos 20 mm de denudación endotelial completa. Este procedimiento se repitió 3 veces y posteriormente se retiró el catéter hasta el punto de entrada.

Retirado el balón, se suturó el lugar de la punción carotídea, y los animales se mantuvieron vivos, con una dieta normal a demanda, hasta el sacrificio. La elección del vaso se debe a la facilidad de acceso al mismo, su diámetro, que permite el uso de balones convencionales (2F Fogarty), y su bilateralidad, que permite disponer de una arteria control.

Para prevenir el desarrollo de infecciones, 2 días antes de realizar la denudación las ratas fueron tratadas con 1,17 g de amoxicilina por litro de agua de bebida a demanda y 0,29 g de ácido clavulánico por litro de agua de bebida a demanda. Este tratamiento se continuó hasta que los animales fueron sacrificados.

Las arterias denudadas con el balón se obtuvieron 6, 24 y 48 h tras la denudación endotelial (6 ratas en cada grupo). En todos los experimentos, la arteria carótida derecha contralateral se usó como control. A los tiempos indicados, las ratas de cada grupo fueron anestesiadas y exsanguinadas. Los posibles restos de sangre fueron lavados por perfusión a través de la aorta abdominal con 100 ml de salino isotónico a una presión de 100 mmHg. Inmediatamente después de estas maniobras, ambas carótidas fueron extraídas y congeladas rápidamente en nitrógeno líquido para su posterior procesamiento.

Expresión de la proteína óxido nítrico sintasa inducible

Se determinó la expresión de la proteína NOSi por la técnica de Western blot. La solubilización de las proteínas se realizó mediante incubación de las muestras con tampón de lisis (0,25 M Cl 2 Mg; 10% glicerol; 5% Nonidet; 0,025 M Hepes; 10 ­4 M PMSF; 10 µ g/ml leupeptina; 10 µ g/ml pepstatina A) durante 1 h a 4 °C. Tras la centrifugación a 13.000 rpm a 4 °C durante 5 min se determinó la concentración de proteínas de las muestras mediante el método de Bradford. Las proteínas se mezclaron con solución de Laemmli 14 conteniendo 2- ß -mercaptoetanol.

Las proteínas se separaron por electroforesis en un gel de 10% de poliacrilamida (15 µ g/línea), transfiriéndose a unas membranas de nitrocelulosa (Immobilon-P, Millipore). Estas membranas se bloquearon mediante incubación a 4 °C durante toda la noche con 5% de albúmina en TBS-T (20 mM Tris-ClH; 137 mM ClNa; 0,1% Tween 20). El análisis de Western blot se hizo con un anticuerpo monoclonal anti-NOSi (Transduction Laboratories, Lexington). Para ello las membranas se incubaron con el primer anticuerpo (1:2.500) durante 1 h a temperatura ambiente y después de sucesivos lavados, se expusieron a un segundo anticuerpo (anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa) a una dilución de 1:1.500 durante 1 h a temperatura ambiente. La proteína específica correspondiente a la NOSi se detectó mediante el revelado de las membranas por quimioluminiscencia (ECL, Amersham) y se evaluó la expresión de la proteína por densitometría (Molecular Dynamics). Para la determinación del peso molecular se usaron proteínas como marcadores del peso molecular (Sigma Chemicals).

Para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal anti-NOSi se hicieron dos comprobaciones. En primer lugar, se analizó la reactividad cruzada del anticuerpo contra la isoforma NOSe usando homogenados de células endoteliales (CE) de rata y de aorta bovina. Los cultivos de CE de rata se realizaron según el método de McGuire et al 15 .

La segunda comprobación de la especificidad del anticuerpo contra la NOSi fue la reacción de reconocimiento con el control positivo obtenido de un homogenado de macrófagos de rata activados con lipopolisacáridos (LPS) de E. coli .

Producción de un suero antiplaquetas de rata

La sangre de 6 ratas fue recogida en una solución al 10% (v/v) de ácido-citrato-dextrosa y centrifugada a 1.000 rpm durante 30 min, a temperatura ambiente, recogiendo de esta forma el plasma rico en plaquetas (PRP) 16 . Las plaquetas fueron obtenidas de ratas Wistar control y se homogeneizaron en el adyuvante de Freund. A continuación se inyectaron de forma subcutánea a un conejo New Zealand White. El plasma del conejo se recogió por plasmaféresis 10 días después de la segunda inmunización. Un suero no inmune, obtenido de conejos que no habían sido inmunizados, se obtuvo también como control (grupo IgG).

Las ratas se dividieron en dos grupos de 6 ratas cada uno, a un grupo se les inyectó el suero antiplaquetas (acAP) y al otro el suero control (IgG), 30 mg/100 mg de peso, 24 h antes de la intervención. Esta dosis de suero acAP produce una grave trombocitopenia, encontrándose recuentos de plaquetas menores de 10.000 células/ µ l a las 24 h de inyectado el suero, lo que representa una reducción del 85% (p < 0,01) con respecto a las cantidades de plaquetas de las ratas tratadas con el suero IgG. Las arterias dañadas se recogieron 6, 24 y 48 h después de la denudación endotelial.

Bloqueo de los receptores de la glicoproteína IIb/IIIa plaquetaria

Se administró a un grupo de 6 ratas abciximab (Reopro, Eli Lilly y Centocor, Leiden Holanda), un fragmento Fab del anticuerpo monoclonal c7E3 de la quimera humano-ratón, que se une al receptor de la glicoproteína IIb/IIIa de la plaqueta, impidiendo su unión. Administramos el abciximab como un bolo intravenoso (500 mg/kg de peso) inmediatamente antes de la desendotelización, seguida de una infusión continua de 10 mg/kg de peso, durante 60 min después de la intervención. Un grupo de 6 ratas tratado con una IgG no específica administrada de la misma forma y dosis que el abciximab se usó como control. Las carótidas dañadas se recogieron 24 h después de la denudación.

Agregación plaquetaria ex vivo

Se evaluó la agregación plaquetaria en respuesta al ADP para comprobar el grado del bloqueo del receptor GP IIb/IIIa inducido por el tratamiento con abciximab. Para ello, 6 ratas fueron infundidas con abciximab siguiendo la misma pauta que la descrita en el caso de las ratas a las que se denudó de endotelio. Inmediatamente después de administrar el fármaco en una infusión durante 60 min, se recogió la sangre y se obtuvo el plasma rico en plaquetas (PRP) como se describió anteriormente 16 . Se realizó en forma paralela en sangre de 6 ratas a las que se administró una IgG no específica. Se ajustó el número de plaquetas de cada rata a 2,5 * 10 8 células/ml. La activación plaquetaria fue medida utilizando un agregómetro (Chronolog, 2 canales). Previamente una muestra pobre en plaquetas se usó como control para establecer el 100% de transmisión de la luz. El PRP (500 µ l) fue incubado a 37 °C en el agregómetro con agitación continua (1.000 rpm) y se estimuló con ADP (10 ­6 mol/l). Para normalizar las medidas, sólo se consideró el valor obtenido a los 3 min de añadir el estímulo, que es cuando se alcanza el máximo de agregación.

Análisis estadístico

Los resultados cuantitativos se expresan como media ± error estándar de la media (X­ ± EEM). Cada resultado corresponde a un mínimo de 6 animales, excepto que se especifique otro valor. Para determinar la significación estadística de nuestros resultados, se realizó un análisis de variancia con prueba de Bonferroni para las comparaciones múltiples o el test de la t de Student, de forma apareada o no apareada, según cada caso. En todos los casos, se consideró que existían diferencias estadísticamente significativas si la p era menor de 0,05. Las pruebas estadísticas se efectuaron mediante el programa Sigma (Horus, Madrid).

RESULTADOS

Expresión de la óxido nítrico sintasa inducible en carótidas desendotelizadas in vivo

Tras realizar la denudación endotelial, observamos una débil expresión de la NOSi a las 6, 24 y 48 h (figs. 1a y b).

La expresión de la NOSi en la carótida desendotelizada con balón fue, sin embargo, más alta que en la carótida contralateral no dañada, ya que en las carótidas con endotelio intacto no se observó expresión de la NOSi (datos no expuestos).

Efecto de las plaquetas en la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible después de la denudación in vivo

Hemos examinado el papel de las plaquetas en la limitación de la expresión de la NOSi en las primeras horas después de la denudación endotelial. Para ello, repetimos el experimento de denudación endotelial carotídea en ratas trombocitopénicas y en ratas control tratadas con un anticuerpo no específico. Se observó que las carótidas de las ratas tratadas con el acAP presentaban una elevada expresión de la NOSi tanto a las 6 como a las 24 y a las 48 h, mientras que a estos mismos tiempos las carótidas de las ratas tratadas con la IgG no específica sólo tenían una ligera expresión de la NOSi. Dentro del grupo de ratas tratadas con el anticuerpo acAP, la expresión de la NOSi fue más evidente a las 24 y a las 48 h después de realizada la denudación endotelial que a las 6 h (figs. 2a y b).

Efecto del bloqueo de la glicoproteína IIb/IIIa en la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible después de la denudación endotelial

Para determinar cómo las plaquetas producían una disminución en la expresión de la NOSi, recurrimos a bloquear el receptor de la GP IIb/IIIa. El bloqueo del receptor GP IIb/IIIa con el abciximab aumentó la expresión de la NOSi después de producido el daño. El tratamiento con la IgG no específica no modificó significativamente la expresión de la NOSi, 24 h después de realizada la denudación endotelial, al compararla con la expresión observada en ratas no tratadas con el abciximab (figs. 3a y b).

El bloqueo de los receptores GP IIb/IIIa por el abciximab se demostró por agregometría, puesto que el tratamiento con el fármaco bloqueaba completamente la agregación en respuesta al ADP, cosa que no ocurría en las ratas que habían sido tratadas con una IgG no específica (ratas tratadas con IgG 50 ± 2, ratas tratadas con abciximab 7 ± 3; n = 6; en porcentaje de transmisión de luz, p < 0,01).

DISCUSIÓN

Este estudio pone de manifiesto que la proteína NOSi se expresa débilmente en la pared arterial en las primeras horas después de la denudación del endotelio, y que las plaquetas desempeñan un papel fundamental en esta limitada expresión de NOSi tras el daño endotelial.

Nuestros hallazgos difieren de los de Hansson et al quienes, también en carótida de rata, observaron una elevada expresión de NOSi poco tiempo después de producir el daño endotelial 17 . Tras la denudación endotelial, las células sanguíneas circulantes se activan y son reclutadas hacia el sitio dañado, donde comienzan a liberar diferentes mediadores inflamatorios, incluyendo citocinas 18 . Por otra parte, las CMLV afectadas pueden ser también fuente de citocinas, por tanto, en el ambiente vascular va a existir una gran concentración de citocinas capaces de estimular la expresión de la NOSi 19,20 . Por otro lado, el promotor del gen de la NOSi tiene un elemento de respuesta a variaciones del flujo sanguíneo, que podría ser estimulado después de dañar el vaso 21 . Teniendo en cuenta todos estos datos, en los primeros tiempos después de realizada la angioplastia hubiéramos esperado encontrar una alta expresión de la NOSi. Sin embargo, y sorprendentemente, nosotros hemos observado que la expresión de la NOSi durante las primeras 48 h después de la denudación endotelial es muy pequeña.

La aparición de la expresión y de la actividad de la NOSi, tanto in vivo como in vitro, en los estudios previamente publicados por otros autores 10,17 podría deberse a la presencia de endotoxemia después de la intervención quirúrgica o a endotoxinas contenidas en el medio de incubación, ya que estos autores no mencionan el uso de ningún tratamiento antibacteriano. En nuestro estudio, las ratas recibieron un tratamiento profiláctico con antibióticos y, de esta forma, quedaba descartada la posible presencia de NOSi debida a una cierta endotoxemia.

Existen dos evidencias indirectas que apoyan nuestros resultados. Teniendo en cuenta que el NO es un potente inhibidor de la proliferación de la CMLV, por un lado, Dzau et al han demostrado recientemente que la transfección in vivo del ADNc de la isoforma NOSe, justo después de la denudación endotelial producida por balón, redujo el crecimiento neointimal hasta en un 70% 22 . Lógicamente, y debido a que la actividad NOSi genera cantidades mucho más elevadas de NO que las generadas por la actividad NOSe, la liberación de NO por parte de la NOSe no sería necesaria para reducir el crecimiento neointimal. Indirectamente los hallazgos de Dzau et al apoyan la débil expresión de la NOSi encontrada en nuestro estudio, tras la angioplastia.

Por otro lado, otros autores como Watkins et al bloqueando la producción de NO endógeno, mediante el uso de un antagonista de la L-arginina inmediatamente después de realizada la denudación endotelial, observaron que no se modificaba el engrosamiento neointimal 23 . Esto podría deberse a que al no existir actividad óxido nítrico sintasa inmediatamente después de la desendotelización el bloqueo de la generación de NO no afectará los mecanismos involucrados en el crecimiento neointimal.

Papel de las plaquetas en la regulación de la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible: importancia de los receptores

La alteración de la integridad endotelial en los vasos sanguíneos produce una rápida activación de las plaquetas. Se ha demostrado que la denudación endotelial producida por balón estimula la adhesión y la agregación plaquetarias en tan sólo unos minutos y que, sin embargo, las plaquetas desaparecen de la superficie arterial unos días después del daño. Por todo esto nos propusimos analizar si las plaquetas activadas podrían estar implicadas en la modesta expresión de la NOSi observada en los primeros momentos tras el daño endotelial, y elegimos tres tiempos (6 h, 24 h y 48 h), para seguir el desarrollo de esta expresión.

Analizamos si las plaquetas regulaban in vivo la expresión de la NOSi, y para esto se realizó la denudación endotelial en ratas a las que se las había hecho deficientes en plaquetas mediante la administración de suero enriquecido en anticuerpo antiplaqueta. Al realizar la denudación endotelial en las ratas trombocitopénicas se observó un aumento en la expresión de la NOSi en los primeros tiempos después de producido el daño.

La estimulación de las plaquetas produce una mayor exposición y una mayor activación de los receptores GP IIb/IIIa de la superficie plaquetaria 24 . En la última parte de nuestro trabajo nos planteamos estudiar si el bloqueo in vivo de los receptores GP IIb/IIIa de la plaqueta favorecería la expresión de la NOSi en los primeros tiempos después de la denudación endotelial. Observamos que el bloqueo de los receptores GP IIb/IIIa mediante la administración de Reopro, además de inhibir la agregación plaquetaria ex vivo, estimulaba la expresión de la NOSi en las arterias desendotelizadas por balón. Estos resultados apoyan la implicación directa de las plaquetas activadas en la inhibición de la expresión de la NOSi, inmediatamente después de la angioplastia. En este punto cabría señalar que las dosis de abciximab utilizadas en este estudio son mayores que las terapéuticas que se usan en humanos. Se realizarán futuros estudios con dosis menores de abciximab, para dilucidar si con dosis terapéuticas de este fármaco se obtienen los mismos resultados.

Kaida et al utilizando un antagonista del GP IIb/IIIa evaluaron la formación neointimal 2 semanas después de realizar la denudación del endotelio en carótida de hámster. Estos autores observaron que la infusión del antagonista reducía significativamente el engrosamiento neointimal 25 . Fingerle et al demostraron que la depleción de las plaquetas circulantes reduce el tamaño de la lesión intimal después del daño por balón, sugiriendo que las plaquetas activadas desempeñan un papel relevante en la formación neointimal 26 .

En la reducción del engrosamiento neointimal encontrado en estos trabajos podría ser importante la mayor capacidad de la pared vascular para generar NO, al inhibir la actividad plaquetaria. En este sentido, hay que recordar una vez más que el NO es un potente inhibidor de la proliferación de las CMLV y de la generación de proteínas de la matriz extracelular. No obstante, serán necesarios experimentos específicos en los que se administre el anticuerpo anti-GP IIb/IIIa y se bloquee la capacidad de la pared vascular de generar NO, mediante el empleo de antagonistas de la L-arginina para poder determinar el papel del NO en los efectos de los inhibidores del GP IIb/IIIa sobre estos mecanismos. En este sentido, cabría recordar que en la activación plaquetaria se liberan diferentes factores de crecimiento que posteriormente podrían estar de alguna manera involucrados en los mecanismos de formación de la neoíntima.

El efecto beneficioso o perjudicial de la actividad NOSi después de la denudación endotelial deberá también ser estudiado. El NO inhibe la proliferación de la CMLV y la síntesis de matriz extracelular 5,8 , lo que podría prevenir la formación neointimal. No obstante, el NO es una molécula citotóxica para las células endoteliales 27 y también inhibe su crecimiento 28 . La rápida reendotelización del vaso dañado es un fenómeno crítico para bloquear la formación neointimal 29 . Sin embargo, la generación continua de NO por la NOSi hace que el sistema del NO en la CE se vea afectado, con lo que se especula que se podría proteger la pared vascular de excesivas cantidades de NO.

En conclusión, se produce una pequeña expresión de la NOSi en las carótidas de las ratas desendotelizadas inmediatamente después de la intervención. En los primeros momentos, las plaquetas parecen desempeñar un papel crucial en la modulación negativa de la expresión de la NOSi en la pared vascular dañada. En este sentido, parece tener una implicación directa la activación de los receptores GP IIb/IIIa. Se necesitan más estudios para determinar si los efectos protectores de la terapia antiplaquetaria en los síndromes coronarios agudos son parcialmente debidos a su capacidad para aumentar la expresión de la NOSi en los primeros momentos después de la denudación endotelial.

AGRADECIMIENTO

Este trabajo fue financiado por Laboratorios Lacer SA. Los Dres. González-Fernández, Rodríguez-Feo y Guerra son becarios de la Fundación Conchita Rábago de la Fundación Jiménez Díaz. La Dra. Sánchez de Miguel es becaria de los laboratorios Bayer. Agradecemos a Eli-Lilly el suministro del abciximab, y a María Begoña Ibarra sus trabajos de secretaría.