Se seleccionó a los individuos evaluados de la población del Aragon Workers’ Health Study (AWHS). El AWHS es un estudio de cohorte longitudinal de los factores de riesgo cardiovascular y de la ateroesclerosis subclínica que se lleva a cabo en 5.400 trabajadores de la fábrica Opel España, situada en Aragón (España), y que han sido objeto de seguimiento desde 200921. Para esta publicación se estudió a los individuos no emparentados de edad ≥ 18 años del AWHS de los que se dispusiera de determinaciones anuales o bianuales desde 2009. Se utilizaron los siguientes criterios para seleccionar a las personas con sospecha clínica de HF: a) participantes con concentraciones de cLDL no tratadas > percentil 95 de la población española estratificada según la edad y el sexo22 en como mínimo 2 determinaciones; b) participantes con EC prematura (edad < 55 años los varones y < 60 años las mujeres) en la situación inicial; c) participantes en tratamiento con estatinas y con cLDL > 130mg/dl en al menos 2 determinaciones, y d) participantes con concentraciones de cLDL no tratadas > percentil 95 de la población española en tan solo 1 determinación pero también el cLDL > 130mg/dl en tratamiento con estatinas. Los criterios de exclusión fueron la presencia basal o durante el seguimiento de causas secundarias de hipercolesterolemia, como obesidad grave (índice de masa corporal [IMC] > 35), diabetes mellitus tipo 2 mal controlada (HbA1c > 8%), enfermedad renal con tasa de filtrado glomerular < 30ml/min y/o macroalbuminuria, hepatopatía (alanina transaminasa > 3 veces el límite superior de la normalidad), hipotiroidismo (tirotropina > 6 mUI/l), embarazo, enfermedades autoinmunitarias y el tratamiento con inhibidores de proteasa. Se definió al sujeto con hiperLp(a) como el individuo con sospecha de HF y una concentración de Lp(a) > 50mg/dl, pero concentraciones de cLDL ajustadas por la Lp(a) normales (< percentil 95 de la población española)22.

Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica de Aragón (CEICA).

Se llevó a cabo una evaluación de los factores de riesgo cardiovascular, los antecedentes personales y familiares de enfermedad cardiovascular, la toma de medicamentos con efectos en el metabolismo lipídico y los parámetros antropométricos de todos los participantes en la situación inicial y luego a intervalos anuales o bianuales durante el seguimiento.

Se realizaron análisis de lípidos y lipoproteínas en muestras de plasma en EDTA obtenidas tras una noche o al menos 10 h en ayunas, a intervalos anuales o bianuales desde el año 2009. Se incluyeron las determinaciones realizadas hasta 2015. Se determinaron las concentraciones de colesterol total y de triglicéridos con métodos enzimáticos estándares. El colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (cHDL) se determinó directamente con una reacción enzimática de la colesterol oxidasa (UniCel DxC 800; Beckman Coulter, Inc., Estados Unidos). El cLDL se calculó con la fórmula de Friedewald. Los valores lipídicos de los participantes que estaban en tratamiento hipolipemiante se ajustaron en función del tratamiento con estatinas23. Ninguno de ellos estaba een tratamiento con inhibidores de la PCSK9. La Lp(a) se determinó mediante nefelometría cinética IMMAGE (Beckman Coulter Inc., Estados Unidos). Se obtuvieron los valores de cLDL ajustados por la Lp(a) restando a la concentración de cLDL calculada con la fórmula de Friedewald la concentración de Lp(a) dividida por 324,25.

Se aisló el ADN genómico de sangre total mediante métodos estándares. Mediante secuenciación de nueva generación con la plataforma SeqProLipo Platform (Progenika Biopharma Grifols, España), de secuenciaron los genes LDLR (NM_000527.4), PCSK9 (NM_174936.3), APOE (NM_000041.3), STAP1 (NM_0121108.3) y LDLRAP1 (NM_015627.2) y los exones 26 y 29 del gen APOB (NM_000384.2), que contienen el código del lugar de unión LDLR. Dicha plataforma incluye mutaciones puntuales, reordenaciones grandes y variaciones en el número de copias.

Para evaluar la patogenicidad de las variantes identificadas, se utilizó SIFT26, PolyPhen-227, Mutation Taster28 y PredictSNP29. El efecto de las variantes en los posibles lugares de corte y empalme se predijo con FruitFly30. Para comparar las frecuencias de las variantes identificadas en los participantes en el estudio y en la población general, se compilaron las frecuencias alélicas de las variantes identificadas procedentes del 1000 Genomes Project31 y los ExAc Browser Data32. Las variantes raras se definieron como las variantes genéticas con una frecuencia <1% de la población general. Una variante rara se definió como variante causal cuando ya estaba asociada con la HF y como variante posiblemente patógena cuando la predicción del análisis bioinformático la clasificaba como patógena.

Los análisis se realizaron con el programa informático de cálculo estadístico R versión 3.5.033. La distribución de las variables se analizó con la prueba de Shapiro. Las variables cuantitativas con una distribución normal se expresan en forma de media ± desviación estándar y se analizaron con una prueba de ANOVA. Las variables con una distribución asimétrica se expresan como mediana [intervalo intercuartílico] y se analizaron con la prueba de Kruskal-Wallis. Las variables cualitativas se expresan en forma de porcentajes y se analizaron con la prueba de la χ2. El nivel de significación estadística se estableció en p < 0,05. Se utilizó una regresión binaria logística para determinar el mejor diagnóstico con los criterios de la European Atherosclerosis Society, tomando la presencia de una mutación en genes candidatos como variable dependiente.

De los 5.400 individuos incluidos en el AWHS, se dispuso de la información necesaria para evaluar los criterios de inclusión y exclusión de 4.514. Se excluyó a un total de 886 individuos porque los datos lipídicos registrados no eran completos, tenían menos de 2 paneles lipídicos completos y/o datos incompletos sobre el uso de fármacos hipolipemiantes. De los 4.514 participantes, 255 (5,65%) cumplían los siguientes criterios de inclusión (que no son mutuamente excluyentes): a) 127 participantes presentaban concentraciones de cLDL no tratadas > percentil 95 de la población española en al menos 2 determinaciones; b) 21 tenían una EC prematura en la situación inicial (edad < 55 años los varones y < 60 las mujeres); c) 39 tenían una concentración de cLDL > 130mg/dl en como mínimo 2 determinaciones pese al tratamiento con estatinas, y d) 113 tenían una concentración de cLDL sin tratamiento > percentil 95 de la población española en 1 determinación y también un cLDL > 130mg/dl en al menos otra ocasión en tratamiento con estatinas (figura 1).

Figura 1.

Criterios de selección y variantes identificadas en los genes de la hipercolesterolemia familiar. EC: enfermedad coronaria; cLDL: colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad.

(0,43MB).

Los participantes con concentraciones de cLDL altas a pesar del tratamiento con estatinas y los que tenían una EC en la situación inicial eran de más edad y tenían un IMC más alto que el resto de los participantes. Los participantes que estaban en tratamiento con estatinas y tenían concentraciones de cLDL altas a pesar del tratamiento farmacológico y aquellos con cLDL elevado en 1 determinación y también concentraciones de cLDL altas en tratamiento con estatinas presentaban unas concentraciones de colesterol total, cLDL y triglicéridos más altas que las de los demás participantes. Los participantes con una EC prematura tenían concentraciones de Lp(a) más altas. Los participantes con concentraciones altas de cLDL en como mínimo 2 determinaciones y que no tomaban ningún tratamiento hipolipemiante fueron el 93,7% (tabla 1).

En el análisis de secuenciación se identificaron 5.280 variantes en genes candidatos en los 255 participantes secuenciados (figura 1): a) 1.792 variantes en el gen LDLR, 11 de las cuales se han descrito como patógenas y ya asociadas con la HF; b) 249 variantes en el gen APOB, aunque ninguna de ellas se ha descrito como patógena ni se ha asociado anteriormente con la HF; c) 1.697 variantes en el gen PCSK9, de las cuales solo 1 se ha descrito como patógena y ya asociada con la HF; d) 72 variantes en el gen APOE, 2 de las cuales ya asociadas con la hiperlipoproteinemia tipo III; e) 869 variantes en el gen STAP1, 3 de las cuales se han descrito como posiblemente patógenas mediante el análisis bioinformático, y f) 601 variantes en el gen LDLRAP1, 2 de las cuales se han clasificado como posiblemente patógenas mediante el análisis bioinformático. Sin embargo, ninguna de estas 2 variantes posiblemente patógenas del gen LDLRAP1 estaba presente en homocigosis, condición esta que se ha descrito como necesaria para causar una hipercolesterolemia.

El porcentaje de mutaciones en genes candidatos fue similar en los diversos grupos; sin embargo, los participantes con concentraciones de cLDL altas en como mínimo 2 determinaciones fueron los que presentaron un porcentaje más alto de mutaciones causales, que superó el 8% de los casos (tabla 1). Un total de 12 pacientes eran portadores de 11 alelos patógenos distintos en heterocigosis en el gen LDLR: 1 de ellos con una variante causal ubicada en la región del promotor (c.-135C>G); 7 de ellos tenían una variante causal situada en regiones codificadoras, con lo que producían un cambio de aminoácido (c.530C>T, c.826T>G, c.862G>A, c.1247G>A, c.1529C>T, c.1775G>A y c.1816G>A); 1 de ellos con una variante causal, situada en una región intrónica, que daba lugar a un cambio de corte y empalme alternativo (c.1586+5G>A); 1 alelo tenía 2 variantes causales situadas en cis: (c.274C>G) y (c.313+1G>C) y 1 de ellos tenía una reordenación grande (c.941-?_1845+?del). Todos estos casos se han descrito como patógenos mediante el análisis bioinformático y ya se habían descrito como causa de HF34-40. Tan solo 1 paciente era portador de una variante rara en el exón 26 del gen APOB, (c.10621A>G). Sin embargo, esta variante no se ha asociado anteriormente como causa de HF, se clasificó como benigna en el análisis bioinformático y no parece que afecte a la estructura de la región de unión. Se halló que 5 pacientes eran portadores de 2 variantes raras en el gen PSCK9 (c.60_65dup GCTGCT y c.743G>A), y solo la primera se ha asociado anteriormente con la HF. De estos pacientes, 4 eran portadores de un indel en el marco de lectura c.60_65dupGCTGCT, que se ha descrito como de patogenicidad incierta o probable por Clin Var41 y Garcia et al.42. También 5 pacientes eran portadores de 3 variantes raras en el gen APOE, ninguna descrita antes como causa de HF. Una de ellas nunca se ha asociado con ninguna hiperlipemia y el análisis bioinformático la clasificó como desconocida en (c.335C>A). Las otras 2 variantes (c.460C>A, c.487C>T) se hallaron en 3 y 1 participantes respectivamente. Ambas variantes ya estaban asociadas con la hiperlipoproteinemia de tipo III43,44. De los 4 pacientes portadores de 3 variantes raras desconocidas en el gen STAP1, 2 eran portadores de 1 variante situada en la región 5’ (c.-60A>G) y los otros 2 eran portadores de 2 variantes diferentes situadas en regiones de codificación, con lo que producían una sustitución de aminoácido (c.619G>A y c.803T>C). Ninguna de estas variantes se ha asociado anteriormente con la HF. Se halló que 2 pacientes eran portadores de 2 variantes raras y desconocidas en heterocigosis en el gen LDLRAP1, y 1 de ellas producía un cambio de aminoácido (c.605C>G), mientras que la otra podía afectar al corte y empalme (c.748-7C>G). Sin embargo, las mutaciones en el gen LDLRAP1 tan solo producen hipercolesterolemia cuando se encuentran en homocigosis (tabla 2 y tabla 1 del material adicional).

En 24 (9,41%) participantes con criterios de sospecha de HF a causa de un cLDL > percentil 95, cuando se analizó el colesterol transportado en la Lp(a), los valores de cLDL dejaron de ser > percentil 95. Ninguno de estos participantes con hiperLp(a) era portador de una mutación patógena en genes candidatos para la HF.

En la tabla 3 se muestran las características clínicas y el perfil lipídico según la clasificación genética, con la inclusión de los participantes con hiperLp(a). Los participantes portadores de mutaciones en el gen LDLR fueron los que mostraron las concentraciones más altas de colesterol total y cLDL. Además, los portadores de mutaciones en el gen PCSK9 presentaban unas concentraciones de colesterol total y cLDL significativamente superiores a las de los portadores de mutaciones del gen STAP1 y los clasificados como casos de hiperLp(a) (p < 0,001 y p < 0,001 respectivamente). Por otra parte, los participantes portadores de mutaciones en el gen STAP1 fueron los que mostraron las concentraciones más bajas de colesterol total y cLDL, inferiores a las de los participantes sin mutaciones en los genes candidatos.

Las mutaciones en el gen LDLR implicaban al 75% de algunas mutaciones en genes candidatos, en comparación con el 25% de ellas en los participantes que eran portadores de alguna mutación en el gen PSCK9. En la figura 2 se muestra el porcentaje de mutaciones según los grupos definidos por las concentraciones de cLDL basales. Cuanto mayor es el porcentaje, mayor es el aumento del cLDL: el 0,40% de los participantes con valores basales de cLDL < 190mg/dl, el 1,20% con cLDL basal de 190-220mg/dl y un 4,80% con cLDL basal > 220 mg/dl presentaban una mutación en genes candidatos. Teniendo en cuenta a los pacientes con una mutación en genes candidatos para la HF más los pacientes con hiperLp(a), casi un 16% del grupo con criterios de sospecha tenía una enfermedad monogénica.

Figura 2.

Porcentaje de participantes con mutaciones causales en función de las concentraciones basales de cLDL. cLDL: colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad.

(0,07MB).

Se utilizó una regresión logística binaria para estudiar la asociación de los datos clínicos con 2 variables de respuesta: mutación en cualquier gen y mutación en el gen LDLR. El análisis mostró que las concentraciones basales de cLDL, el cLDL ajustado por la Lp(a) y el colesterol total tenían una asociación significativa con la presencia (sí/no) de cualquier mutación en los genes candidatos (odds ratio [OR] = 1,023; p <0,001; OR = 1,024; p < 0,001; OR = 1,017; p < 0,001) (tabla 4A-C). No obstante, ningún criterio mostró una asociación significativa con la presencia de cualquier mutación en los genes candidatos. La presencia de una mutación en el gen LDLR (sí/no) mostró una asociación significativa con las cifras basales de colesterol total y cLDL (OR = 1,009; p =0,010; OR = 1,016; p = 0,0488) y con los criterios de sospecha de HF: concentraciones de cLDL sin tratamiento superiores al percentil 95 en 1 determinación junto con una concentración de cLDL > 130mg/dl en tratamiento con estatinas (p = 0,011) (tabla 4D).

En la tabla 5 se muestra el número de participantes con una mutación en función de los criterios que cumplían, los valores predictivos positivo y negativo y la sensibilidad y la especificidad respecto a la muestra seleccionada por la presencia de al menos 1 criterio. El primer criterio fue el que mostró el valor predictivo positivo más alto (10,2%) para detectar mutaciones funcionales en los genes candidatos (genes LDLR,PCSK9 y STAP1), en especial para detectar mutaciones en los genes LDLR y PCSK9 (el 6,3 y el 2,4%). No obstante, el cuarto criterio fue el que mostró un valor predictivo positivo más alto para detectar mutaciones en el gen LDLR (8,0%), y mostró en esta muestra seleccionada una especificidad superior a la del primer criterio (0,510 y 0,572 respectivamente).

Nuestro estudio tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, el AWHS es una cohorte con grandes prevalencias de varones, obesidad, hipertensión e hipercolesterolemia, y ello puede hacer que no sea representativa de la población general. Sin embargo, dado que se trata de una población relativamente joven, no habrá un sesgo en la prevalencia de mutaciones de HF. En segundo lugar, se presentan algunas mutaciones, como la c.743G>A en PCSK9 y la c.10621A>G en APOB, que tienen una significación incierta. No obstante, ambas se han descrito como neutras o benignas mediante el análisis bioinformático y la base de datos ClinVar, por lo que no hay datos suficientes para clasificarlas como variantes patógenas. Los análisis de secuenciación del gen APOB incluyeron solo los exones 26 y 29, mientras que la secuenciación del gen APOB completo podría mostrar otras variantes como causa del fenotipo de HF. Sin embargo, la hipercolesterolemia debida a defectos del gen APOB requeriría que la proteína tuviera una unión defectuosa con el receptor de LDL, ya que las mutaciones que causan solo una menor expresión o un plegado inadecuado de la ApoB causarían hipocolesterolemia. Así pues, es de prever que las variantes causantes de HF estén situadas en la región de codificación del dominio de unión de la ApoB (en los exones 26 y 29). De hecho, la mayoría de las mutaciones del gen APOB descritas como causa de HF se han identificado en el exón 2649. Por último, las mutaciones posiblemente patógenas de PCSK9 (c.60_65dupGCTGCT) y STAP1 (c.-60A>G, c.619G>A y c.803T>C) requerirán nuevos estudios para disponer de una perspectiva más amplia respecto a su papel en el fenotipo de HF.