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Vol. 59. Núm. 2.
Páginas 154-164 (Febrero 2006)
DOI: 10.1157/13084643
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Sobre los genes paraoxonasa-1 y SR-B1, y su importancia en la aterosclerosis
Concerning the Significance of Paraoxonase-1 and SR-B1 Genes in Atherosclerosis
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Francisco Rodríguez Esparragóna, Yaridé Hernández Trujilloa, Antonio Macías Reyesa, Enrique Hernández Ortegab, Alfonso Medinab, José C Rodríguez Pérezc
a Unidad de Investigación. Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC). Las Palmas de Gran Canaria. España.
b Servicios de Cardiología. Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC). Las Palmas de Gran Canaria. España.
c Unidad de Investigación. Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC). Las Palmas de Gran Canaria. España. Nefrología. Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC). Las Palmas de Gra
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Fig. 1. Esquema general del metabolismo de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y su papel protector frente a la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL).
Fig. 2. A. Disminución significativa de la actividad paraoxonasa en 68 varones diabéticos frente a 93 no diabéticos ajustados por edad. B. Disminución significativa de la actividad paraoxonasa en 161 varones después de un evento coronario agudo y en 184 controles ajustados por edad123. Las barras representan la media y la desviación típica. La comparación se realizó mediante el test de la t de Student.
Fig. 3. A. Diferente comportamiento de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) de acuerdo con las isoformas paraoxonasa en prevenir la oxidación del L-1-palmitoil-2-araquidonil-sn-glicero-3-fosforilcolina más ácido hidroperoxioctadecadienoico. Las muestras de HDL se aislaron por precipitación y se ajustaron con tampón salino a 20 unidades de arilesterasa107,108. Los experimentos se realizaron mediante el ensayo libre de células (J Lipid Res. 2001;42:1308-17). B. Diferente comportamiento de HDL de acuerdo con las isoformas paraoxonasa en prevenir su propia oxidación. La determinación de la peroxidación lipídica se llevó a cabo mediante el método del Xylenol Orange (FOX) (Biochem J. 1996;313:781-6). Todos los experimentos se realizaron en presencia de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)107,108.
Fig. 4. A: concentración media de homocisteína plasmática total de acuerdo con los genotipos PON-1 Gln192Arg (RR (Arg/Arg); QR (Gln/Arg); QQ (Gln/Gln) en un grupo control de 243 varones sanos y sin tratamiento farmacológico107,108. B: concentración media de homocisteína plasmática total (tHcy) de acuerdo con los genotipos PON-1 Gln192Arg en un grupo de 20 pacientes tratados con estatinas107,108.
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La lipoproteína de alta densidad (HDL) constituye un factor de protección independiente de enfermedad cardiovascular. La enzima paraoxonasa-1 (PON-1) contribuye a las propiedades antiaterogénicas asociadas al HDL. Estudios in vitro muestran que posee una gran heterogeneidad de sustratos, algunos de los cuales participan en la progresión de las lesiones ateroscleróticas. Se han desarrollado modelos animales que muestran su papel ateroprotector. En humanos, las variantes PON-1 Gln192Arg y Met55Leu parecen asociarse con una mayor susceptibilidad cardiovascular, con diferentes actividades y concentración de la proteína PON-1. El gen CLA-1 (CD36 and Lysosomal integral membrana protein-II Analogous-1) es el homólogo humano del gen SR-B1 (Scavenger Receptor class B type 1) y constituye el primer receptor de alta afinidad de HDL bien caracterizado. El receptor CLA-1 participa en el transporte reverso de colesterol a través de la entrada selectiva de ésteres de colesterol nativos y oxidados, y su papel ateroprotector se ha deducido de los estudios en animales genéticamente manipulados. En humanos, el gen CLA-1 es polimórfico y algunas de sus variantes han sido previamente asociadas con cambios fenotípicos en lipoproteínas plasmáticas. Ambos genes participan en el complejo metabolismo del HDL y, presumiblemente, en los mecanismos de defensa frente a estrés oxidativo.
Palabras clave:
Paraoxonasa
SR-B1
Ésteres de colesterol
Estrés oxidativo
Homocisteína
High-density lipoprotein (HDL) is an independent protective factor against cardiovascular disease. The enzyme paraoxonase-1 (PON-1) contributes to the anti-atherogenic effects of HDL. In vitro studies have demonstrated that paraoxonase's substrates are highly heterogeneous and that some contribute to the development of atherosclerotic lesions. The atheroprotective role of PON-1 was established in genetically engineered animal models. In humans, the PON-1 Gln192Arg and Met55Leu polymorphisms appear to be associated with increased susceptibility to cardiovascular disease and with different PON-1 activity levels and concentrations. The CLA-1 (CD36 and Lysosomal integral membrane protein-II Analogous-1) gene is the human homologue of the murine SR-B1 (Scavenger Receptor class B type 1) gene. SR-B1 was the first high-affinity HDL receptor to be identified at the molecular level. The CLA-1 receptor plays a pivotal role in HDL-mediated reverse cholesterol transport by mediating the selective uptake of free cholesterol as well as of native and oxidized cholesteryl esters. Its atheroprotective role has also been established in transgenic mice studies. Several polymorphic variants of the CLA-1 gene have been described, some of which are associated with phenotypic changes in plasma lipoproteins. Both genes participate in the complex HDL metabolic pathway and, presumably, also in defense mechanisms against oxidative stress.
Keywords:
Paraoxonase
SR-B1
Cholesteryl esters
Oxidative stress
Homocysteine
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INTRODUCCIÓN

El proceso de generación aumentado de radicales libres y especies reactivas de oxígeno, en ocasiones unido a una disminución de los mecanismos de defensa antioxidantes, constituye la base de la hipótesis oxidativa de la aterosclerosis1. La modificación oxidativa de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y la generación de productos derivados permite su acumulación dentro de la pared arterial y acelera el proceso aterosclerótico1,2. Inicialmente, cualquier sistema enzimático en el que se generen radicales libres podría estar involucrado en la oxidación de las partículas LDL, incluidos el sistema NADPH oxidasa, la mieloperoxidasa, el P450, la cadena transportadora de electrones mitocondrial, la xantina oxidasa y la lipoxigenasa. En cuanto a esta última, su importancia inicialmente documentada en estudios in vitro3-5 se ha visto refrendada por diversos estudios in vivo6-10 y por la demostración en ratones doble knockout para apolipoproteína E y 12/15 lipoxigenasa (apoE-­/-­/L-12LO-­/-­) de una disminución relevante de las lesiones ateroscleróticas11,12. Pese a todo, también se han evidenciado resultados contradictorios13.

Mecanismo de seeding

La acción de la 15 y 12 lipoxigenasas sobre el ácido araquidónico y linoleico genera, principalmente, los ácidos hidroperoxioctadecadienoico (HPODE) e hidroperoxieicosatetraenoico (HPETE). Numerosas aportaciones experimentales justifican que, al menos parcialmente, el mecanismo de formación de las LDL mínimamente oxidadas se debe a la oxidación de fosfolípidos derivados del ácido araquidónico y a la incorporación de los propios productos derivados del metabolismo de lipoxigenasas, especialmente HPODE y HPETE, sobre distintos lípidos de las LDL14. Sin embargo, para que se produzca una oxidación efectiva, las LDL han de ser adicionalmente «sembradas» con especies reactivas de oxígeno14,15. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y su principal componente estructural, la apolipoproteína AI, evitan la oxidación de las LDL1. Hay distintos mecanismos moleculares involucrados que acontecen tras una transferencia de ésteres de colesterol peroxidados (CEOOH) desde las LDL a las HDL, en un proceso parcialmente determinado por la actividad enzimática de la proteína de transferencia de ésteres de colesterol (CETP)16. Pese a lo dicho, el papel de la CETP es potencialmente aterogénico y el uso protector de los inhibidores de la CETP (JTT-705 y torcetrapib) se muestra en diferentes ensayos clínicos17,18. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el mecanismo de transferencia de ésteres de colesterol (CE) desde las HDL a lipoproteínas cuyo contenido proteínico es la apolipoproteína-B (proceso que se produce en intercambio por triglicéridos) es bidireccional y depende de la concentración de lipoproteínas ricas en triglicéridos16,19. Como es conocido, más que las concentraciones elevadas de HDL es su renovación lo que probablemente tiene mayor relevancia en la protección vascular. En particular, la acción de la CETP en las HDL facilita la actividad de esterificación de la LCAT (lecitin-colesterol aciltransferasa) y, por tanto, el eflujo de colesterol. A su vez, la acción combinada de CETP y de la lipasa hepática sobre HDL maduras (HDL2) genera fracciones de HDL pobres en lípidos que son mejores aceptores de colesterol17,20.

El mecanismo de formación de LDL mínimamente oxidadas consta al menos de tres pasos14,15. El primero consistiría en el mencionado sembrado de las LDL con productos del metabolismo del ácido araquidónico y con CEOOH14. El segundo, en el trasvase de las LDL al espacio subendotelial, donde se produciría una acumulación adicional de especies reactivas del oxígeno. Y el tercero, conlleva la oxidación de fosfolípidos de las LDL cuando se alcanza un nivel umbral de especies reactivas del oxígeno15. En el primero de los pasos descritos es donde presumiblemente interviene la actividad enzimática paraoxonasa. En la figura 1 se muestra un esquema general de los mecanismos discutidos en esta revisión.

Fig. 1. Esquema general del metabolismo de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y su papel protector frente a la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL).

Sobre la medición plasmática de fosfolípidos oxidados e hidroperóxidos

La heterogeneidad metodológica al tratar de valorar la peroxidación lipídica en el plasma depende no sólo de la propia técnica utilizada, sino de si la valoración se realiza sobre el contenido en lípidos peroxidados totales o en determinadas subfracciones. Esto ha generado diversas discrepancias sobre el contenido normal de peróxidos en sujetos sanos. Mediante HPLC y detección por quimioluminiscencia, Bowry et al21 determinaron en plasma y en lipoproteínas aisladas (HDL y LDL) que las HDL portaban el 85% del contenido total de CEOOH y el total de fosfolípidos peroxidados (PLOOH), detectados como hidroperóxidos de fosfatidilcolina. Por el contrario, Nourooz-Zadeh et al22 analizaron el contenido total en hidroperóxidos lipídicos y comprobaron que radicaban mayoritariamente en las LDL y no en las HDL.

Sobre las paraoxonasas 1, 2 y 3 (PON-1, PON-2 y PON-3)

La paraoxonasa/arilesterasa humana (PON-1) (EC 3.1.1.2) es una glucoproteína calcio-dependiente que se encuentra unida a las partículas de HDL. Se ha intentado demostrar que la paraoxonasa sérica disminuye el riesgo de enfermedad coronaria por su acción destructora de moléculas proinflamatorias involucradas en la iniciación y la progresión de las lesiones ateroscleróticas23. El potencial antiaterogénico de la paraoxonasa vendría dado por su capacidad de hidrolizar lípidos oxidados, fosfolípidos y CEOOH, limitando su acumulación en las LDL. Estudios in vitro han mostrado que la actividad paraoxonasa previene la oxidación de las LDL24 e incluso la oxidación de las propias HDL25. PON-1 in vivo parece actuar de forma similar26-28. PON-1 se caracteriza por hidrolizar, además, distintos ésteres de ácidos carboxílicos y algunos organofosfatos. Pese a que el sustrato fisiológico real de la enzima PON-1 no se conoce bien, ha sido posible determinar su actividad sérica utilizando como sustrato el paraoxón. Mediante la determinación de esta actividad se ha observado que los valores séricos paraoxonasa varían entre individuos y, sin embargo, permanecen relativamente constantes en un individuo dado23. Distintas situaciones fisiopatológicas vinculadas a un aumento del estrés oxidativo y factores ambientales producen una disminución de la actividad sérica paraoxonasa29-34. Contrariamente, se ha descrito un aumento del estrés oxidativo en ratones knockout PON-1 y en los doble knockout apo E/PON-1 y, en estos modelos, una respuesta diferente de la expresión en macrófagos de PON-2 y de PON-335,36.

La unión entre la paraoxonasa y la partícula de HDL se constituyó, en parte, como una posible explicación a la relación inversa entre los valores de HDL y la enfermedad coronaria mostrada en distintos estudios poblacionales23. La actividad antioxidante justificaría su papel protector, actividad que ha de conservarse incluso en el proceso de transporte reverso de colesterol. Así, la esterificación del exceso de colesterol se realiza en la superficie de las HDL y es mediada por la actividad LACT, la cual es especialmente sensible a hidroperóxidos lipídicos37,38. Es importante tener en cuenta que la actividad enzimática paraoxonasa se restringe a ciertas subfracciones del HDL39 y que es necesaria la apolipoproteína AI para su estabilidad40.

El gen humano PON-1 se localiza en el brazo largo del cromosoma 7 (7q21-q22)41 y presenta algunas variantes de interés42. El polimorfismo Gln192→Arg (Q/R) determina los alelos PON1 A (Q) y PON1 B (R) asociados con una menor/mayor actividad de la enzima dependiendo del sustrato. El polimorfismo Met55→Leu determina la aparición de los alelos L (leucina 55) y M (metionina 55). La variante Met55→Leu es la causante de modificaciones en las concentraciones séricas, pero no en la actividad enzimática paraoxonasa43.

El polimorfismo Gln192→Arg del gen PON-1 ha sido asociado con la enfermedad vascular en diabéticos44-47 y en no diabéticos por algunos grupos46, pero no por otros48-50. Se han publicado algunos metaanálisis que muestran una asociación débil de la variante con la enfermedad cardiovascular34,51,52. Toda vez que hay otros determinantes no genéticos que afectan a la variabilidad interindividual de la actividad PON-1, algunos autores sugieren la conveniencia de considerar conjuntamente en los estudios de asociación, los genotipos y actividad PON-134,53. Además, el hecho de que la asociación no se muestre en todas las poblaciones estudiadas sugiere que no se trata de una mutación funcional, sino de un marcador de otra mutación en el propio gen PON-1 o en otro gen cercano54. Por otro lado, es posible que haya interacciones en el genotipo y el medio ambiente todavía no bien caracterizadas o prevalentes en poblaciones concretas, que resulten determinantes para estos estudios55,56.

El interés del polimorfismo Met55→Leu como factor de riesgo genético para la enfermedad cardiovascular fue evaluado por Garin et al43, quienes encontraron que la homocigosis Leu55 constituía un factor de riesgo independiente para la enfermedad cardiovascular en diabéticos.

El mecanismo por el cual los polimorfismos en el gen PON-1 incrementan la susceptibilidad cardiovascular se desconoce. La presencia de los alelos 192R y 55L significa una mayor actividad enzimática hacia el paraoxón y, sin embargo, constituyen variantes de riesgo en determinados grupos poblacionales. Este hecho constituyó, durante cierto tiempo, un importante dilema, puesto que se vinculaba la actividad de hidrólisis frente al paraoxón con la actividad frente al sustrato enzimático real. Para explicar esta paradoja se propusieron algunas teorías. Así, la actividad enzimática paraoxonasa disminuida tras el infarto de miocardio29, en la hipercolesterolemia familiar30, la diabetes31 y asociada al fallo renal32,33 sugería la influencia directa en la modulación de la actividad y la concentración enzimática del estrés oxidativo (fig. 2). Por otro lado, la mayor actividad hidrolítica hacia el paraoxón o hacia otros sustratos exógenos no implicaría, como se ha dicho, una mayor capacidad antioxidante. A esta última explicación contribuyó su correspondiente confirmación experimental en humanos. Mackness et al57 comprobaron que la capacidad de protección frente a la oxidación de las LDL conferida por las partículas de HDL resultaba mayor para los homocigóticos QQ/MM que para los homocigóticos RR/LL (fig. 3). Cao et al58 observaron que las diferencias con respecto a la hidrólisis del paraoxón en función de la variante Gln192→Arg no afectaban a la capacidad protectora de la proteína PON-1 frente a la oxidación de las LDL. Aviram et al25 observaron que, tras inactivar la actividad PON-1 arilesterasa (calcio-dependiente) no se eliminaba la capacidad enzimática de inhibir la oxidación de las LDL; por el contrario, el calor abolía dicha capacidad de inhibición. Estos autores sugirieron sitios activos diferentes de PON-1, uno causante de la actividad paraoxonasa calcio-dependiente y otro, calcio-independiente, donde reside la capacidad de protección frente a la oxidación de las LDL58.

Fig. 2. A. Disminución significativa de la actividad paraoxonasa en 68 varones diabéticos frente a 93 no diabéticos ajustados por edad. B. Disminución significativa de la actividad paraoxonasa en 161 varones después de un evento coronario agudo y en 184 controles ajustados por edad123. Las barras representan la media y la desviación típica. La comparación se realizó mediante el test de la t de Student.

Fig. 3. A. Diferente comportamiento de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) de acuerdo con las isoformas paraoxonasa en prevenir la oxidación del L-1-palmitoil-2-araquidonil-sn-glicero-3-fosforilcolina más ácido hidroperoxioctadecadienoico. Las muestras de HDL se aislaron por precipitación y se ajustaron con tampón salino a 20 unidades de arilesterasa107,108. Los experimentos se realizaron mediante el ensayo libre de células (J Lipid Res. 2001;42:1308-17). B. Diferente comportamiento de HDL de acuerdo con las isoformas paraoxonasa en prevenir su propia oxidación. La determinación de la peroxidación lipídica se llevó a cabo mediante el método del Xylenol Orange (FOX) (Biochem J. 1996;313:781-6). Todos los experimentos se realizaron en presencia de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)107,108.

Tras la caracterización inicial del gen PON-1 se identificaron nuevos genes (PON-like) designados PON-2 y PON-3, respectivamente, localizados también en 7q21.359,60. Al contrario que PON-1, que se expresa mayoritariamente en el hígado, PON-2 se expresa en distintos tejidos.

Mochizuki et al59 identificaron varias formas del ARNm del gen PON-2 producidas por splicing alternativo o constituidos por un segundo sitio de inicio de la transcripción. Asimismo, estos autores caracterizaron dos polimorfismos en la secuencia codificadora del gen: Arg148→Gly y Cys311→Ser.

En indios asiáticos, Sanghera et al61 observaron, al estudiar las variantes polimórficas PON-1 (Gln192→Arg) y PON-2 (Cys311→Ser), que ambas contribuían sinérgicamente al riesgo cardiovascular.

Como se ha comentado con anterioridad, la familia génica paraoxonasa está constituida por 3 miembros: PON-1, PON-2 y PON-3. El papel fisiológico de los productos génicos correspondientes constituye un campo de creciente interés. Hasta el momento se han caracterizado y purificado la paraoxonasa/arilesterasa sérica PON-1 y la paraoxonasa PON-3 de suero de conejo62. Al contrario que PON-1, PON-3 presenta una actividad arilesterasa limitada y ausencia completa de actividad paraoxonasa; sin embargo, hidroliza rápidamente lactonas y su actividad protectora frente a la oxidación inducida por Cu2+ de las partículas LDL es superior a la descrita para la proteína PON-1.

¿Qué enzima es la principal causante de la actividad antioxidante de las HDL?

Las propiedades antioxidantes de las HDL no son exclusividad propia de la enzima paraoxonasa. La más importante es la acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas (PAF-AH). La actividad enzimática PAF-AH plasmática inactiva el factor activador de plaquetas (PAF) y, por tanto, regula su función y sus efectos fisiopatológicos63. Aproximadamente el 70% de la actividad plasmática PAF-AH se asocia a las LDL y el resto a las HDL, sugiriéndose que hay un intercambio activo entre ambas fracciones64. PAF-AH hidroliza lípidos peroxidados y actúa a modo de fosfolipasa A2, pero no C o D, y su papel antiaterogénico es controvertido65-68. Marathe et al69 publicaron un excelente trabajo que sugiere que PAF-AH es la causante de toda la actividad hidrolasa de fosfolípidos oxidados y no la actividad enzimática paraoxonasa. Como se ha comentado, PON-1 es una enzima calcio-dependiente. mientras que la actividad PAF-AH no lo es. PAF-AH es una fosfolipasa A2 que pertenece a la familia de las serina-esterasas y, por tanto, puede inhibirse su actividad con inhibidores específicos que bloquean la actividad PAF-AH, pero no la actividad PON. Esta última carece de residuos serina en su sitio activo. Usando esta estrategia en fracciones purificadas PON-1 se muestra que es PAF-AH la única fosfolipasa A2 de las HDL y que PON-1 carece de actividad fosfolipasa sobre PAF o sobre fosfolípidos oxidados. Pese a todo lo anterior, hay evidencias directas de que PON-1 al menos debe estar presente para justificar propiedades antioxidantes y antiaterogénicas27-70. Algunos autores muestran actividad de hidrólisis de PAF por la PON-1 sérica utilizando inhibidores específicos de la actividad PAF-AH71. Además, en el modelo de ratón knockout para el gen PON-1, la actividad PAF-AH permanece similar al salvaje27-72. La lipoproteína HDL aislada de ratones knockout PON-1 es proinflamatoria, es decir, en ausencia de PON-1, la actividad PAF-AH es incapaz de preservar las propiedades antioxidantes de las HDL27,72. En animales transgénicos que expresan PON-1 humano se comprueba cierto grado de protección frente al desarrrollo de aterosclerosis27,70 como también, por otro lado, lo presentan los modelos murinos que sobreexpresan PAF-AH67,73,74. Alternativamente se ha propuesto una actuación coordinada de ambas enzimas in vivo, ya que difieren en su afinidad hacia fosfolípidos oxidados en función de la longitud de la cadena del ácido graso esterificado en la posición sn-225,64,71,75,76. Estos excelentes trabajos completan los realizados por Aviram et al77,78 y Rozenberg et al36,79, quienes utilizaron isoformas recombinantes Q y R y observaron, in vitro y en lesiones ateroscleróticas, que la hidrólisis de lípidos oxidados se producía de forma diferencial, Q (33% de capacidad de reducción de oxidación de las LDL inducida por Cu2+) > R (20% de reducción). Los últimos trabajos publicados se han centrado en desarrollar métodos que permitan obtener una proteína paraoxonasa cada vez más pura. En éstos se ha observado que la proteína «sola» parece incapaz de evitar la oxidación de las LDL80-82. Otros mecanismos moleculares que median la protección vascular en la interacción HDL-paraoxonasa han sido recientemente comunicados83,84.

Sobre la actividad tiolactona hidrolasa

La homocisteína (Hcy) medida como homocisteína plasmática total (tHcy) es considerada un factor de riesgo independiente y gradual de la enfermedad cardiovascular85-87. Los determinantes en las variaciones plasmáticas de tHcy son en su mayor parte conocidos e incluyen tanto factores ambientales como genéticos88-90. Las hipótesis moleculares que vinculan las concentraciones elevadas de Hcy con la enfermedad pasan por una toxicidad directa sobre las células endoteliales, la oxidación de la Hcy, el crecimiento de células musculares lisas y la activación de genes de importancia en el desarrollo de la aterosclerosis91-94. Los incrementos de Hcy en el plasma se asocian con otros procesos de afección proteínica. El 80-90% de la Hcy plasmática se encuentra unido a proteínas, la mitad aproximada de este porcentaje a través de puentes disulfuro y la otra mitad aproximadamente formando enlaces amida más estables95,96. En el interior celular, la edición por parte de ciertas aminoacil-t-ARN sintasas de la Hcy conlleva la formación de un tioéster: la homocisteína tiolactona97. En estudios in vitro se ha demostrado que la formación de esta lactona es directamente proporcional a la concentración de Hcy e inversamente proporcional a la concentración de metionina, y es inhibida por la administración de ácido fólico97,98. Si el mayor porcentaje de Hcy se encuentra unido a proteínas y, además, hay un mecanismo de edición de la Hcy, la pregunta siguiente sería: ¿la incorporación de Hcy a proteínas acontece durante la traducción o bien es postraduccional? Las evidencias in vitro realizadas en determinados tipos celulares muestran que dicha incorporación es postraduccional99,100. Esto es especialmente importante porque, también derivado de estudios in vitro, se sugiere que la N-homocisteinilación de proteínas está mediada por la conversión metabólica de la Hcy en su correspondiente lactona en determinadas situaciones fisiológicas. La detoxificación de homocisteína tiolactona constituye, pues, un mecanismo crucial. Distintos estudios muestran que la actividad enzimática de hidrólisis de estas lactonas es una función de la enzima paraoxonasa99. La identidad molecular también se ha puesto de manifiesto. ¿Es esta actividad hidrolítica sobre la homocisteína tiolactona el papel fundamental de PON-1?

La actividad tiolactona hidrolasa y las isoformas paraoxonasa

Jakubowski et al101 demostraron que la actividad de hidrólisis de homocisteína tiolactona difiere en función de los genotipos PON-1. Así, se encontró una alta actividad tiolactonasa en sujetos portadores de los alelos R192 y L55 y una baja actividad en los sujetos portadores de los alelos Q192 y M55. Los autores sugieren una idea cuya veracidad parece confirmarse en algunos estudios, esto es, la baja actividad lactonasa podría constituir un factor de riesgo cardiovascular importante en los sujetos con concentraciones plasmáticas de Hcy elevadas. Billecke et al102 mostraron que la especificidad de las isoformas Q y R hacia distintas lactonas es variable, y que también lo es hacia distintos ésteres de ácidos carboxílicos. Sin duda, esto justificaría observaciones clínicas previas sobre efectos farmacológicos diferenciales de fármacos hipolipemiantes sobre la actividad paraoxonasa sérica103-108 (fig. 4).

Fig. 4. A: concentración media de homocisteína plasmática total de acuerdo con los genotipos PON-1 Gln192Arg (RR (Arg/Arg); QR (Gln/Arg); QQ (Gln/Gln) en un grupo control de 243 varones sanos y sin tratamiento farmacológico107,108. B: concentración media de homocisteína plasmática total (tHcy) de acuerdo con los genotipos PON-1 Gln192Arg en un grupo de 20 pacientes tratados con estatinas107,108.

Sobre el gen SR-B1 (CLA1)

En el metabolismo de la partícula HDL se produce un proceso de captación celular selectiva de sus componentes de forma que penetran los CE pero no el componente proteínico109. Este proceso de entrada selectiva está mediado, en el ratón, por un receptor scavenger de clase B y tipo 1, scavenger receptor class B type 1, o SR-B1110,111. Constituye éste el primer receptor de las HDL bien caracterizado molecularmente110.

En 1993, Calvo y Vega112 identificaron una nueva secuencia relacionada con el receptor CD36 y con la proteína lisosomal integral de membrana II (LIMPII). El nuevo gen fue denominado CLA-1 por «CD36 y LIMPII análogo 1». Murao et al113 comprobaron que la secuencia SR-B1 era idéntica en un 81% a la secuencia CLA-1. El gen CLA-1 presenta dos formsplicing alternativo originando dos mensajeros de los que se ha deducido dos proteínas de 409 y 509 aminoácidos, respectivamente. La forma identificada por Murao et al113, similar a SR-B1, corresponde a la de 509 aminoácidos.

Acton et al110 han identificado en una población control sana varios polimorfismos en la secuencia del gen humano CLA-1. Los autores caracterizaron variantes intrónicas (intrones 3 y 5) y exónicas (exones 1, 8 y 11) mediante análisis conformacional de cadena simple y secuenciación. A nuestro juicio, dos resultan especialmente interesantes. El cambio Gly→Ser, que se localiza en el segundo aminoácido codificado en la molécula de ADNc (sustitución G/A en la primera base de la tripleta), ya que se asoció, en varones, con mayores concentraciones plasmáticas de HDL y menores concentraciones de LDL. Por otro lado, la sustitución C→T, localizada en la tercera base del codón 350 de la molécula de ADNc, se asoció con menores concentraciones de LDL en mujeres.

Sobre CLA-1 (SR-B1) y propiedades antioxidantes de las HDL

Hay varios mecanismos por los cuales las HDL ejercen efectos antiaterogénicos. El primer lugar lo ocupa el transporte reverso de colesterol, mecanismo por el cual las HDL captan el exceso de colesterol procedente de tejidos extrahepáticos, que tras ser esterificado por acción de la LCAT, es transportado selectivamente al hígado, donde se produce la entrada mediada por CLA-1 de los CE110-112,114 (fig. 1). La entrada de CE en el hígado está acoplada a la síntesis y la secreción de ácidos biliares115,116. La importancia antiaterogénica del receptor CLA-1 en el metabolismo de las HDL es fundamental, como se ha concluido de la generación de modelos murinos con pérdida de los genes SR-B1 y LCAT y de modelos, también en ratón, con sobrexpresión transitoria de SR-B1114,117-119.

CLA-1/SR-B1 media en el flujo bidireccional de colesterol y fosfolípidos sin esterificar entre las HDL y diversos tipos celulares. El papel fisiológico de este mecanismo bidireccional no está suficientemente aclarado120.

La importancia antiaterogénica de las HDL también deriva de su actividad antioxidante directa e indirecta, ya que son capaces de captar CEOOH desde las LDL, siendo posteriormente eliminados en el transporte reverso como hidróxidos de ésteres de colesterol (CE-OH)121. Algunos autores muestran que la mayor parte de los CEOOH en humanos se encuentran asociados a las HDL21, mientras que otros muestran que son las LDL22. En nuestro contexto, resulta también especialmente interesante resaltar que la entrada selectiva de CEOOH en células parenquimales hepáticas, mediada por CLA-1, es aproximadamente tres veces superior que para CE nativos121.

El papel de SR-B1 en el metabolismo de las HDL ha planteado una cuestión fundamental. Se trataba de determinar si la expresión hepática de SR-B1 favorecía la aterogénesis al disminuir las concentraciones de HDL, o bien resultaba antiaterogénica al eliminar CE. Los datos expuestos con anterioridad muestran un papel fundamentalmente antiaterogénico. Esto se debe a que su expresión es primordialmente hepática, dando un papel relevante a su actividad como receptor scavenger; además, parece haber una regulación diferente al menos en macrófagos y en células de Kupffer. Algunos mecanismos de regulación son sutiles. Así, las propias HDL regulan en macrófagos la expresión de SR-B1. Las HDL inducen la activaci&oacut e;n de PPAR-gamma (mensajero y proteína) y su translocación al núcleo, pero también inducen la fosforilación mediada por MAP-cinasas de PPAR-gamma impidiendo de este modo la expresión de genes de respuesta (SR-B1 y CD36 entre otros), sugiriendo por tanto un mecanismo por el cual las HDL inhiben la acumulación lipídica122.

Sobre CLA-1 (SR-B1), PON-1 y la oxidación de lípidos: hipótesis

Navab et al14,15 presentaron las evidencias experimentales que justifican el mecanismo de seeding o sembrado de las LDL. Estos y otros experimentos demostraron igualmente que la acción de las HDL normales sobre las LDL inactiva de manera eficaz la carga aterogénica de éstas. También se ha demostrado que hay un transporte reverso que participa en su eliminación. Es más, este transporte reverso de fosfolípidos peroxidados, pero especialmente de CEOOH es, como se ha comentado, mucho más eficaz que el de fosfolípidos y CE nativos121. Por lo tanto, resultaría lógico suponer que la actividad enzimática PON-1 de eliminación de fosfolípidos peroxidados y CEOOH y su eliminación a través de la ruta del transporte reverso de colesterol contribuirían de forma sinérgica a la reducción del riesgo cardiovascular.

Nosotros hemos intentado abordar esta cuestión a través del análisis de las variantes alélicas polimórficas descritas en el gen CLA-1 (exones 1 y 8 e intrón 5) tratando de asignarles un fenotipo mensurable y determinar un riesgo cardiovascular asociado para, posteriormente, en una segunda fase, tratar de evaluar si había asociaciones de algún tipo con algunas de las variantes alélicas descritas en el gen PON-1. Pudimos comprobar la presencia de este sinergismo genético, y también que algunas de las variantes alélicas CLA-1 modulan el contenido plasmático de CEOOH. Sin embargo, no obtuvimos evidencias fenotípicas similares asociadas a las variantes PON-1123.

CONCLUSIONES

Al papel ateroprotector vinculado al transporte reverso se ha de sumar el efecto antioxidante de las diversas enzimas asociadas con las HDL. La identificación de múltiples sustratos para la enzima paraoxonasa-1 amplía la perspectiva de protección vascular mediada por las HDL, si bien quedan por identificar los mecanismos moleculares precisos por los que ésta se produce. La caracterización del receptor CLA-1, de su función y de su posible papel como determinante de variación de las concentraciones plasmáticas de lípidos oxidados contribuye al conocimiento del metabolismo de las HDL y sugiere la necesidad de abordajes más completos en los estudios en humanos, además de posibilitar la creación de nuevas dianas terapéuticas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el trabajo realizado por la técnica Dña. Lidia Estupiñán-Quintana.

Este trabajo se ha realizado en el seno de un Proyecto de Investigación del Instituto de Salud Carlos III (FIS 01/0190) y FUNCIS 6/2002 (con ampliación).


Correspondencia: Prof. J.C. Rodríguez Pérez.

Unidad de Investigación-Nefrología. Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín.

Barranco de la Ballena, s/n. 35010 Las Palmas de Gran Canaria. España.

Correo electrónico: jrodperd@gobiernodecanarias.org

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