Se realizó al probando un estudio genético que incluyó 173 genes mediante tecnología de secuenciación de nueva generación (next-generation sequencing [NGS]) (Illumina HiSeq; Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer, Thermo Fisher Inc., Estados Unidos). Se consideraron las variantes candidatas en función de los criterios de patogenicidad habituales7. El ADN se obtuvo a partir de muestras de sangre de adultos y de saliva de pacientes pediátricos. Se consideró que había segregación si una variante aparecía en todos los sujetos afectados y no en los sujetos sin el fenotipo. Se determinó cosegregación significativa con un valor discriminatorio de N1/328.

Las corrientes de HCN4 (IHCN4) se registraron con la técnica de fijación de membranas en células de ovario de hámster chino transfectadas tanto con canales HCN4 no mutados (WT) como con canales mutados, tal como se ha descrito previamente9. Las densidades de corrientes se calcularon mediante la normalización de su amplitud en relación con la capacidad de la célula. Se analizó la dependencia del voltaje de la activación del canal HCN4 y se ajustaron las funciones de Boltzmann a los datos para calcular a qué potencial de membrana se activaban el 50% de los canales (Vh) y la pendiente (k) de la curva. La selectividad iónica de los canales HCN4 se evaluó midiendo las relaciones de densidad de la IHCN4 de los canales completamente activados.

La evaluación clínica y el estudio genético de todos los miembros de la familia se ajustaron a los principios establecidos en la Declaración de Helsinki. Se informó a todos los pacientes de los objetivos de la investigación. En el caso de los menores, siempre se requirió el consentimiento de sus padres. Se evaluó a todos los sujetos en la unidad de cardiopatías familiares. El estudio inicial incluyó un electrocardiograma de 12 derivaciones y un ecocardiograma transtorácico.

Se consideró que los sujetos podían estar afectados si su frecuencia cardiaca (FC) era< 60 lpm (o en función del valor límite de referencia para la edad de los pacientes pediátricos10) o si mostraban hipertrabeculación/ausencia de compactación en la ecocardiografía transtorácica según los criterios estándar11,12. El estudio se completó con resonancia magnética cardiaca (RMC), Holter de 24 h y ergoespirometría junto con ecocardiografía transtorácica. Se diagnosticó MCNC a los pacientes que cumplían los criterios de Petersen o Jacquier13,14. Para los pacientes pediátricos, se individualizaron las indicaciones de pruebas complementarias.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con la versión 20.0.0 del software SPSS de IBM (IBM Corp., Estados Unidos). Las variables cualitativas se expresaron mediante número absoluto (n) y porcentaje (%) y las cuantitativas continuas, mediante la media±desviación estándar o la mediana (intervalo).

Los resultados del estudio funcional se expresaron con media±error estándar de la media y se compararon mediante la prueba de la t de Student, ANOVA seguida de prueba de Tukey o prueba de la U de Mann-Whitney, según su ajuste a la normalidad, así como con modelos de efectos mixtos combinados. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo para todos los análisis. Pueden hallarse más detalles sobre la metodología en el material adicional.

El probando era un varón de 18 años (III.19) con bradicardia sinusal, sin antecedentes clínicos de interés. El electrocardiograma en reposo mostró un intervalo QRS estrecho e intervalos PR y QT normales, con una elevación del punto J en las derivaciones inferiores (figura 1A). Los registros de Holter de ECG demostraron una FC mínima de 32 lpm y media de 44 lpm. La ergoespirometría objetivó una clase funcional excelente. La ecocardiografía transtorácica reveló DAi, dilatación del ventrículo izquierdo con hipertrabeculación y fracción de eyección normal (figura 1B,C). El estudio con RMC cumplía criterios diagnósticos de MCNC (figura 1D,E).

Figura 1.

Pruebas adicionales realizadas en el probando. A: electrocardiograma que indica bradicardia sinusal. B: ecocardiograma transtorácico apical de 4 cámaras que muestra hipertrabeculación profusa apical en el ventrículo izquierdo (asterisco). C: foto en telesístole que muestra dilatación auricular izquierda (flecha). D: resonancia magnética cardiaca que muestra hipertrabeculación de ambos ventrículos (flechas) que cumple los criterios de miocardiopatía no compactada del ventrículo izquierdo. E: resonancia magnética cardiaca en telesístole que muestra dilatación auricular izquierda (flecha).

(0,59MB).

No había antecedentes familiares de implante de marcapasos o muerte súbita cardiaca. Todos los familiares estaban asintomáticos en el momento de someterse a la evaluación inicial, excepto la madre del probando (II.10). Tenía antecedentes de FA paroxística y se había realizado con éxito una ablación de venas pulmonares. La abuela materna (I.2) murió a los 85 años debido a un ictus y el abuelo (I.1), a los 72 por una insuficiencia cardiaca de origen desconocido.

Se pudo evaluar a 22 sujetos: 2 familiares de primer grado (madre y hermana) y otros 20 de la línea materna (figura 2). En la primera evaluación, parecían afectados 12 familiares, todos ellos con bradicardia sinusal. Una prueba genética positiva lo confirmó después.

El análisis genético del probando identificó 3 variantes de significado incierto en heterocigosis: NM_005477.2:c.1123C>T;(p.R375C) en el gen HCN4, NM_001281740.1:c.1701C>A;(p.F567L) en el gen FHOD3 y NM_004415.2:c.4632G>T;(p.R1544S) en el gen DSP. De estas variantes, solo la c.1123C>T;(p.R375C) del gen HCN4 mostró segregación en la familia de acuerdo con el fenotipo. La variante p.R375C estaba registrada previamente (rs755356387) con una frecuencia alélica total de 0,000003977 (Base de Datos de Agregación de Genomas [gnomAD])15. La bradicardia sinusal mostró una penetrancia completa, incluso en los sujetos pediátricos. Así pues, teniendo en cuenta a los miembros de la familia afectados y no afectados, la bradicardia sinusal mostró una cosegregación muy fuerte (n=1/218). La penetrancia de hipertrabeculación/MCNC fue incompleta, con expresividad variable entre los sujetos, pero también mostró una cosegregación significativa (n=1/25). En este caso, para calcular la cosegregación solo se tuvo en cuenta a los sujetos afectados (figura 2). Las características principales de los portadores de la variante del gen HCN4 se muestran en la tabla 1 y la tabla 2.

Figura 2.

Árbol genealógico de la familia con la variante del gen HCN4. Los números que hay debajo del símbolo del sujeto indican la identificación del miembro de la familia. Cuadrados/círculos: varón/mujer. Asterisco (*): individuos estudiados por el equipo clínico. Símbolos tachados: personas fallecidas. Sombreados por la izquierda: bradicardia sinusal. Sombreados por la derecha: MCNC. Medio sombreados por la derecha: hipertrabeculación sin criterios de MCNC. Sombreado azul en la parte izquierda superior: dilatación auricular izquierda. G1: genotipo para HCN4:p.R375C; G2: genotipo para FHOD3:p.F567L; G3: genotipo para DSP:p.R1544S.+/–: heterocigosis; –/– homocigosis (no mutado). MCNC: miocardiopatía no compactada del ventrículo izquierdo.

(0,18MB).

El recuadro de la izquierda de la figura 3A muestra el trazado de la IHCN4 generado tras aplicar pulsos de 2 s entre –140 y+20mV en fases de 10mV desde un potencial de retención de –40mV a células de ovario de hámster chino que expresan canales HCN4 WT. Los pulsos hiperpolarizantes generaron una corriente entrante que se activó lentamente hasta alcanzar un nivel estable, cuya amplitud disminuyó de manera progresiva a potenciales más positivos. Comparados con los canales WT, los canales HCN4 p.R375C generaron una corriente entrante menor y de activación más lenta (figura 3A, recuadro central). Teniendo en cuenta la situación de heterocigosis de los portadores, las células se cotransfectaron con los canales HCN4 WT y HCN4 p.R375C en una proporción 1:1. La amplitud de IHCN4 generada por la cotransfección fue inferior a la generada por los canales WT (figura 3A, recuadro de la derecha). Al analizar la densidad de IHCN4 en los distintos potenciales de membrana, se confirmó que las densidades de IHCN4 generadas por los canales p.R375C eran significativamente inferiores a las generadas por los canales WT+p.R375C y WT (n ≥ 16; p <0,01) (figura 3B). Además, la disminución de IHCN4 era evidente tanto en potenciales de membrana muy negativos (–140mV) (figura 3C) como fisiológicos (–60mV) (n ≥ 16; p <0,01) (figura 3D). Curiosamente, la densidad de la corriente generada por la cotransfección de los canales WT y p.R375C fue la mitad de la generada por los canales WT (n ≥ 16; p <0,01). Estos resultados indican que los canales p.R375C no actúan como «proteínas tóxicas» con un efecto negativo dominante.

Figura 3.

Análisis electrofisiológico de la variante del gen HCN4. A: grupos de trazados de IHCN4 generados en células CHO que expresan de manera temporal canales HCN4 WT, p.R375C y WT+p.R375C mediante la aplicación del protocolo representado en la parte superior. B: relación densidad-voltaje generada en células que expresan canales WT, p.R375C y WT+p.R375C. C y D: densidad de IHCN4 generada por canales WT, p.R375C y WT+p.R375C con la aplicación de pulsos a –140 mV (C) o –60mV (D). E: las densidades de la corriente de cola generadas por distintos canales tras aplicar pulsos de 1 s a –140mV se normalizaron y representaron frente al potencial de membrana del pulso de la prueba; las líneas continuas representan el ajuste de Boltzmann a los datos. F: el potencial de membrana que activa el 50% (Vh) de los canales WT, p.R375C y WT+p.R735C. G: relación densidad-voltaje de la IHCN4 totalmente activada generada por canales WT, p.R375C y WT+p.R375C; las líneas continuas representan la regresión lineal con respecto a los datos. H: Einv de los canales calculado a partir de la intersección de la regresión lineal con respecto a los datos con el eje de las abscisas de cada uno de los experimentos; de B a H, cada punto/barra representa la media±EEM de al menos 15 experimentos/células de al menos 3 placas. CHO: ovario de hámster chino; EEM: error estándar de la media; Einv: potencial inverso; IHCN4: corrientes de HCN4; WT: wild-type. ap <0,01 frente a HCN4 WT. bp <0,05 frente a HCN4 WT. cp <0,05 frente a p.R375C.

(0,5MB).

Para cuantificar la cinética de activación, se ajustó una función monoexponencial a la activación del trazado generado por los pulsos a –130mV. Las constantes de tiempo de la activación de la IHCN4 (τ) se situaron en una media de 495±44, 1.960±387 y 727±85 ms en los canales HCN4 WT, HCN4 p.R375C y HCN4 p.R375C+WT respectivamente (n ≥ 16, p <0,01).

En la figura 3E se muestra un análisis de la activación de los canales HCN4 dependientes de voltaje (véase en el material adicional los registros patch-clamp). Los canales p.R375C se activaron a potenciales más negativos que en los canales WT, un efecto que explica probablemente la reducción de la densidad de la corriente producida por la variante. De hecho, Vh se hiperpolarizó de manera significativa (n ≥ 17; p <0,01) (figura 3F). La activación de los canales WT+p.R375C también se desplazó a potenciales negativos comparada con la de los canales WT (n ≥ 18; p <0,05) (figura 3E,F).

Para determinar si la variante altera la selectividad iónica de los canales HCN4, se determinó la relación entre las densidades de IHCN4 de los canales totalmente activados (figura 3G). Se calculó el potencial inverso (Einv) desde la intersección de la regresión lineal de los datos con el eje de las abscisas a concentraciones extracelulares e intracelulares de K+ de 30 y 142mM (véase en el material adicional los registros patch-clamp). El Einv no se modificó con la expresión solo de los canales p.R375C ni con la coexpresión con los canales WT (n ≥ 15; p> 0,05) (figuras 3G,H). Estos resultados indican que la variante no modificó la selectividad iónica de los canales HCN4.

El individuo II.9 realizó su seguimiento clínico en otro centro médico, y no se dispone del estudio completo. Todos los portadores genéticos cumplían los criterios de disfunción sinusal y ninguno mostró FA en el electrocardiograma Holter (tabla 1). Curiosamente, IV.8 y IV.9 eran gemelas bivitelinas de 5 años; IV.9 (no portadora genética) tenía una FC en reposo de 100 lpm, en comparación con los 75 lpm de IV.8 (portadora de la variante HCN4).

La ecocardiografía transtorácica demostró fenotipo de hipertrabeculación/MCNC en 10 de los 12 portadores genéticos (83%), DAi en 7 de los 12 portadores genéticos (58%) y un corazón normal en 2 sujetos pediátricos (tabla 1). No se observaron otras alteraciones estructurales en los individuos.

Se realizó RMC a 8 pacientes (se excluyó a los pacientes pediátricos) (tabla 2); 4 pacientes cumplieron los criterios diagnósticos de MCNC y otros 4 mostraron hipertrabeculación no patológica del ventrículo; 5 pacientes tenían dilatación moderada del ventrículo izquierdo y un tamaño normal del ventrículo derecho, y el probando (III.19) tenían una dilatación grave de ambos ventrículos. En 3 portadores de la variante HCN4 (III.1, III.4 y III.6) la FEVI era intermedia. En relación con los datos sobre deformación miocárdica, solo 1 paciente (III.1) presentó strain longitudinal global (GLS) y strain circunferencial global (GCS) patológicos. No se observó realce tardío de gadolinio en ningún paciente y en todos los valores de T1 nativo (965±15,8 ms) y volumen extracelular (21,7%±1,2%) fueron normales. Se observó DAi en todos los pacientes, grave en el 89%, y en todos la fracción de eyección auricular en la RMC fue normal (fracción de eyección, 56,6%; GLS, 35,8%).

Se realizaron ergoespirometrías a todos los portadores genéticos adultos (tabla 1). Todos los portadores completaron la tercera fase del protocolo de Bruce y en 6 de ellos se observaron latidos ventriculares ectópicos. Los ecocardiogramas de esfuerzo mostraron una reserva contráctil positiva, sin otros indicadores patológicos. Todos los pacientes se hallaban en una clase funcional normal para el VO2 máximo teórico predicho (111%±15%), con un comportamiento normal del pulso de O2 (142%±30%) y VO2 en el umbral anaeróbico superior al predicho (72%±15%). Se evaluó mediante una prueba de esfuerzo convencional sobre cinta sin fin a los portadores pediátricos, que mostraron una clase funcional normal, sin arritmias significativas.

Al final de este estudio, todos los miembros de la familia estaban vivos (seguimiento medio, 29±9 meses) y en ninguno se había desarrollado insuficiencia cardiaca. Aparte del paciente con FA diagnosticada previamente, no se han documentado otras arritmias. En consecuencia, ningún paciente requirió marcapasos o desfibrilador automático implantable.

Los resultados muestran que la variante p.R375C modifica profundamente la dependencia de voltaje y la cinética de activación del canal HCN4. Esto redujo de un modo significativo la disponibilidad del canal y disminuyó la densidad de la corriente generada. Se ha demostrado con anterioridad la causalidad de las variantes del HCN4 mediante análisis electrofisiológico celulares4,5,17–19. Los canales HCN4 mutados no eran funcionales, lo cual resultó en una reducción de la corriente If. Los datos electrofisiológicos del presente estudio proporcionaron pruebas sólidas de la causalidad de la variante p.R375C en la patogenia de la bradicardia sinusal observada.

El residuo p.R375C se localiza en el segmento S4 de los canales HCN4 y es uno de los 7 residuos de este dominio del canal cargados positivamente (figura 4). De hecho, el segmento S4 es el sensor de voltaje del canal y la variante sustituye uno de los residuos de Arg cargados positivamente por un residuo polar neutro (Cys). Esto explica a la perfección los cambios profundos producidos por la variante en la dependencia de voltaje y la cinética de la activación del canal. Anteriormente se describieron resultados parecidos para la variante p.R378C observada en un paciente con SSE20.

Figura 4.

Esquema de un canal mutado HCN4 c.1123C>T;(p.R375C). Ilustración de la estructura del canal HCN4 que representa las variantes que combinan MCNC y el fenotipo de SSE descritos hasta la actualidad. La Arg375 (círculo) se localiza en el segmento S4 y es uno de los 7 residuos cargados positivamente de este dominio que constituye el sensor de voltaje del canal. MCNC: miocardiopatía no compactada del ventrículo izquierdo; SSE: síndrome del seno enfermo.

(0,28MB).

La MCNC se ha relacionado con distintas variantes que afectan a los genes del sarcómero, del citoesqueleto y de la membrana nuclear. Los modelos animales indican que la hipertrabeculación se debe a una alteración en la regulación de la proliferación, la diferenciación y la maduración celulares durante la formación de la pared del ventrículo21.

Hasta ahora, se conocen como mínimo 8 variantes distintas del gen HCN4 relacionadas con este fenotipo combinado (P883R, K645X, A485E, G482R, Y481H, I479V, A414G, R393H)4,5,17–19. Podría haber una relación entre el desarrollo del sistema de conducción cardiaco y la maduración del miocardio que explicaría la concomitancia de miocardiopatía y arritmias específicas22. Estas variantes del HCN4 podrían considerarse la «vía común final» que producen el fenotipo mixto23, pero todavía no se ha demostrado de qué modo se desarrolla la hipertrabeculación. Otra hipótesis sobre la aparición de la MCNC es que se trate de un rasgo adquirido de remodelación adaptativa en respuesta a la bradicardia sinusal5. En estudios previos, se ha descrito que los genes que codifican canales iónicos (SCN5A y RYR2) participan en la fisiopatología de la miocardiopatía24,25. En este estudio, se hallaron algunos datos confusos sobre si la familia tiene un rasgo fenotípico adquirido o una miocardiopatía real. En casi todos los portadores, los resultados de la FEVI y la deformación del miocardio fueron normales o intermedios, así como la clase funcional y la reserva contráctil positiva. Ninguno de los sujetos analizados presentó realce tardío de gadolinio ni alteraciones en el volumen extracelular o los mapas en T1.

Curiosamente, se observó una gran penetrancia de DAi con contractilidad auricular normal. Este hallazgo no se había relacionado previamente con las variantes del gen HCN4. Se desconoce cuál es el mecanismo causante de la DAi. Tal como se ha explicado previamente, la DAi podría ser resultado de una alteración real de la estructura anatómica auricular, ya que el HCN4 contribuye al desarrollo embrionario del ventrículo izquierdo y ambas aurículas26, o podría ser una adaptación fisiológica a la bradicardia sinusal.

La relación entre las variantes del gen HCN4 y el fenotipo combinado del SSE, la DAi y la MCNC es innegable. El patrón sin compactación mostrado por los pacientes con la variante p.R378C del gen HCN4 indica poca agresividad y buen pronóstico. La remodelación de la aurícula izquierda es un importante sustrato para la FA y podría relacionarse con la aparición de la FA hereditaria, ya asociada con las variantes del gen HCN417.

Actualmente no están establecidos la evaluación y el seguimiento de los pacientes con variantes emergentes del gen HCN4. El seguimiento que se propuso para esta familia tiene por objetivo principal detectar complicaciones arrítmicas, principalmente en los fenotipos con DAi, con una alta probabilidad de aparición de FA, y disfunción ventricular sistólica. Se decidió llevar a cabo una revisión clínica anual con electrocardiograma y electrocardiograma Holter. El ecocardiograma se repetirá cada 1 o 2 años (excepto por cambios en la situación clínica).

Este estudio incluyó únicamente a una familia y no fue posible evaluar a todos sus miembros. No obstante, se ha evaluado a un gran número de ellos. De hecho, este estudio hace referencia a la mayor familia relacionada con el gen HCN4 descrita hasta la fecha, evaluada mediante un estudio clínico exhaustivo que incluyó ergoespirometría y RMC.

Como en los casos descritos previamente, nuestro trabajo no explica el mecanismo del efecto de la variante del gen HCN4 en la aparición de hipertrabeculación del ventrículo izquierdo o DAi. Sin embargo, este es el primer trabajo en que se examinó a los pacientes mediante RMC con técnicas paramétricas y deformación miocárdica, y se ha demostrado la existencia de una posible disfunción sistólica subclínica y DAi con posibles implicaciones clínicas.