En el presente estudio se utilizaron 22 perros beagle de ambos sexos, con una media±desviación estándar de peso de 13,5±2,4kg. El estudio se atuvo a lo establecido en la versión actual de Guide for the care and use of laboratory animals (Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio), publicada por los National Institutes of Health (n.o 85-23, revisión de 1996). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Wuhan. El manejo de los animales se realizó según lo establecido por la Directiva de Investigación con Animales de Wuhan.

Se administró una inyección intramuscular de sulfato de quetamina (25mg/kg) antes de la medicación de pentobarbital sódico. Se administró a todos los perros pentobarbital sódico (30mg/kg por vía intravenosa), se les intubó y se les ventiló con aire ambiental con suplemento de oxígeno utilizando un respirador (MAO01746, Harvard Apparatus; Holliston, Montana, Estados Unidos). Se realizó una monitorización continua del electrocardiograma empleando las derivaciones I, II y III. El grupo 1 lo formaron 7 perros a los que se administró dimetilformamida (0,1 ml/kg). El grupo 2 lo formaron 8 perros a los que se administró deshidromonocrotalina (DHMC). El grupo 3 lo formaron 7 perros a los que se administró DHMC y se les practicó ablación arterial renal. El grupo 1 se consideró de control (con objeto de descartar el efecto de la dimetilformamida sobre la HAP, se utilizó la dimetilformamida como control), el grupo 2 fue el grupo de HAP, y el grupo 3 fue el grupo de HAP + SR.

La DHMC se sintetizó artificialmente según lo descrito por Mattocks et al13. La pureza de la DHMC se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento14. La DHMC se disolvió en dimetilformamida (0,1 ml/kg) inmediatamente antes de la inyección.

Después de obtener una anestesia estable, se inyectaron a todos los animales 1.000 U de heparina y se introdujeron vainas hemostáticas en la vena femoral derecha. Con guía de fluoroscopia, se introdujo por la vena un catéter pulmonar Swan-Ganz 6 Fr (Edwards Lifesciences; Irvine, California, Estados Unidos) lleno de una solución salina heparinizada. El catéter se conectó a un transductor de presión y a un sistema de monitorización Vigilance. El catéter arterial pulmonar se introdujo en las arterias pulmonares pequeñas a través de la aurícula y el ventrículo derechos. A continuación se retiró el catéter, y se realizaron determinaciones de la presión capilar pulmonar enclavada, la presión arterial pulmonar sistólica, la presión arterial pulmonar media, la presión sistólica ventricular derecha y la presión media ventricular derecha. Se determinó el gasto cardiaco con el método de termodilución continua utilizando el sistema de monitorización Vigilance. Se calculó la resistencia vascular pulmonar según la fórmula (resistencia vascular pulmonar = 80 × [presión arterial pulmonar media – presión capilar pulmonar enclavada] / gasto cardiaco). Después de las determinaciones hemodinámicas basales, a los animales de los grupos de HAP y de HAP + SR se les inyectó DHMC (2mg/kg), y a los animales de control, dimetilformamida (0,1ml/kg) mediante un catéter arterial pulmonar Swan-Ganz introducido en la aurícula derecha. En el grupo de HAP + SR, después de las determinaciones hemodinámicas basales, se llevó a cabo la intervención de SR igual que en un estudio previo15. A continuación se dejó que todos los animales se recuperaran durante 8 semanas. Después de 8 semanas, se repitieron todas las determinaciones hemodinámicas en los tres grupos.

Se realizó una ecocardiografía transtorácica bidimensional y Doppler en todos los animales (IE33, S5-1, PHILIPS; Países Bajos) en la situación basal y nuevamente al cabo de 8 semanas. Se obtuvieron proyecciones estándares bidimensionales paraesternales cortas y largas, así como proyecciones apicales tetracamerales, bicamerales y tricamerales. Se determinaron las dimensiones auricular izquierda, auricular derecha, diastólica ventricular izquierda y diastólica ventricular derecha mediante la fórmula biplanar de Simpson. Las determinaciones de todos los volúmenes se realizaron por triplicado, y se presentaron los valores medios. Se analizó el strain longitudinal telesistólico ventricular derecho mediante la técnica de speckle tracking (rastreo de marcas) bidimensional. Un experto en ecocardiografía independiente revisó las imágenes y los parámetros.

Se extrajeron 4ml de sangre venosa en tubos Vacutainer con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y se centrifugaron a 2.310g durante 10min a 4°C (Beckman Coulter, Avanti J-E) en la situación basal y de nuevo al cabo de 8 semanas. Se separó el suero, se colocó en microtubos y se conservó a –80°C hasta el momento del análisis. Se determinaron las concentraciones de creatinina, AII, prostaglandina E2 y endotelina-1 (ET-1) mediante un ELISA. Se aisló el lóbulo inferior del pulmón izquierdo tras una toracotomía. Se determinaron las concentraciones de AII, prostaglandina E2 y ET-1 en el pulmón con un método descrito con anterioridad16. Se obtuvieron muestras de tejido de la base del ventrículo derecho de todos los animales al cabo de 8 semanas. Se determinaron las concentraciones de aldosterona y péptido natriurético tipo B mediante un ELISA.

Los pulmones izquierdos extirpados se procesaron para el examen de microscopia óptica aplicando métodos convencionales. Se trocearon las muestras de tejido en fragmentos pequeños, se incluyeron en parafina, se realizaron cortes de 3μm de grosor y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los cortes se observaron, se analizaron y se fotografiaron con un microscopio óptico Nikon eclipseCi. Se identificaron las arterias pulmonares como vasos con dos láminas elásticas claramente definidas, con una capa de células de músculo liso entre las dos láminas. Se midió el grosor de la pared de las arterias de 15 arterias musculares a 400 aumentos.

Se determinó la expresión del receptor de AII tipo 1 (AT1) y los receptores de AII tipo 2 (AT2) en la arteria pulmonar mediante el método de Western blot. Se bloquearon las membranas con leche seca sin grasa al 5% en solución salina tamponada Tris con Tween durante 1h y se incubaron durante una noche a 4°C con los anticuerpos primarios (anticuerpos anti-AT1 y anti-AT2 monoclonales de conejo [Santa Cruz Biotechnology Inc.; Dallas, Texas, Estados unidos], utilizados a 1:500; anticuerpo antiactina de conejo [Santa Cruz Biotechnology Inc.], utilizado a 1:1.000). A continuación se lavaron en solución salina tamponada Tris con Tween tres veces, se incubaron con el segundo anticuerpo durante 1h a 37°C, y se realizó el revelado con sustrato de peroxidasa de rábano Inmun-Star. Se determinó la expresión relativa de proteína con un programa informático analizador de imagen (AlphaEase FC, Estados Unidos).

Se disecaron del corazón cortes del ventrículo y se conservaron rápidamente a –80°C. Se obtuvieron cortes ventriculares derechos del infundíbulo de salida ventricular derecho. Se utilizó la tinción de tricrómico de Masson para identificar el aumento de concentración de fibrosis intersticial. El tejido conjuntivo se diferenció por su color y se expresó como porcentaje del área de tejido de referencia (NIKON Ti-s, Japón). Se excluyeron de la cuantificación del tejido conjuntivo los vasos sanguíneos y las células intersticiales perivasculares. Se determinó la fracción de volumen de colágeno intersticial mediante morfometría cuantitativa con un analizador de imagen (IPP 6.0, Media Cybemetics; Georgia, Estados Unidos).

Los valores se presentan en forma de media±desviación estándar. Los resultados de la ecocardiografía en los grupos de HAP y de HAP + SR se compararon para el periodo posterior al estudio mediante la prueba de la t para datos apareados, y se utilizaron pruebas de la t de Student para dos muestras independientes en la comparación de las medias de los dos grupos. Se utilizaron pruebas de análisis de la varianza en forma de pruebas de Neuman-Keuls para la comparación de las medias de las variables continuas en múltiples grupos, y toda diferencia significativa observada se analizó luego con la prueba de Tukey-Kramer. Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales, y se exigió un valor de probabilidad < 0,05 para establecer la significación estadística.

No hubo diferencias significativas de la presión arterial, la frecuencia cardiaca o el peso corporal en la situación basal entre los tres grupos experimentales. En el grupo de HAP + SR, la presión arterial sistólica se redujo después de 8 semanas, pero esta disminución no alcanzó significación estadística. Los perros con HAP empezaron a presentar una respiración rápida y disminución del apetito a partir del décimo día tras la inyección. El color del pulmón fue más pálido en los perros con HAP y con HAP + SR que en los animales de control. Las características existentes en la situación basal y después de 8 semanas se presentan en la tabla 1.

En cambio, el diámetro auricular derecho aumentó significativamente después de 8 semanas en los perros con HAP (p = 0,02). No se observaron diferencias significativas en el diámetro auricular derecho antes o después de 8 semanas en los grupos de control y de HAP + SR. Se observaron también aumentos significativos del diámetro diastólico ventricular derecho en los perros con HAP. El diámetro diastólico ventricular derecho presentó un aumento en el grupo de HAP + SR después de 8 semanas, pero este aumento no tuvo significación estadística (p = 0,09). Después de 8 semanas, el strain longitudinal de la pared lateral del ventrículo derecho se redujo en el grupo de HAP y en el grupo de HAP + SR. Sin embargo, el strain longitudinal fue superior en el grupo de HAP + SR que en el de HAP (tabla 2).

Los datos hemodinámicos en la situación basal y después de 8 semanas de los tres grupos se presentan en la tabla 3. No hubo diferencias significativas en los índices hemodinámicos pulmonares basales de los tres grupos. En comparación con el valor basal, la presión arterial pulmonar y la presión ventricular derecha fueron superiores después de 8 semanas en el grupo de HAP. No hubo diferencias significativas en los parámetros hemodinámicos en la situación basal y después 8 semanas en el grupo de control. La presión arterial pulmonar y la presión ventricular derecha aumentaron después de 8 semanas en el grupo de HAP + SR, pero estos parámetros hemodinámicos fueron inferiores en los perros del grupo de HAP + SR que en el grupo de HAP.

El grupo de HAP presentó un aumento estadísticamente significativo de las concentraciones de AII en plasma y en tejido pulmonar al final del protocolo (p < 0,01) en comparación con el valor basal (tabla 4). No hubo diferencias significativas en las concentraciones plasmáticas de AII entre la determinación basal y el final del estudio en los grupos de control y de HAP + SR. Entre la situación basal y el final del estudio, no se observaron diferencias significativas en las concentraciones de creatinina en plasma ni en las de prostaglandina E2 en tejido pulmonar de los tres grupos.

No se dieron diferencias significativas en la situación basal entre los tres grupos en cuanto a las concentraciones de ET-1 en suero. Después de 8 semanas, las concentraciones de ET-1 en suero aumentaron (p < 0,01) en los perros con HAP, pero no se observaron diferencias estadísticamente significativas en los animales de control. En el grupo de HAP + SR, la concentración de ET-1 en suero se redujo después de 8 semanas, pero esta disminución no alcanzó significación estadística (p = 0,19). La concentración de ET-1 en el tejido pulmonar fue significativamente superior en el grupo de HAP que en el de control (p < 0,01). Además, la concentración de ET-1 en el tejido pulmonar fue superior en el grupo de HAP + SR que en el de control (p = 0,01).

Se estudió con mayor detalle las concentraciones de aldosterona y de péptido natriurético tipo B en el ventrículo derecho. Los resultados indicaron que las cifras de aldosterona y péptido natriurético tipo B en las muestras de tejido de la base del ventrículo derecho eran más altas en los dos grupos en que se había inducido HAP que en los animales de control. Tiene interés señalar que las concentraciones de aldosterona y de péptido natriurético tipo B en el ventrículo derecho del grupo de HAP fueron superiores a las observadas en el de HAP + SR. Esto confirma que el grupo de HAP + SR presentó un remodelado ventricular derecho menos intenso que el grupo de HAP (tabla 4).

La tinción de hematoxilina-eosina mostró en el grupo de HAP un engrosamiento significativo de la íntima y estenosis luminal en comparación con el grupo de HAP + SR. En la figura 1 se muestran cambios representativos observados en la estructura vascular de los tres grupos. La oclusión por neoíntima se evaluó mediante puntuación de oclusión vascular. Se calculó una puntuación de oclusión vascular media de los 30 vasos seleccionados para cada uno de los perros como índice de la oclusión vascular. Los resultados pusieron de manifiesto que se producían lesiones de neoíntima en el 64% de las arterias pulmonares pequeñas seleccionadas del grupo de HAP. La media de la puntuación de oclusión vascular fue de 1,17 en esas arterias. En cambio, los perros del grupo de HAP + SR desarrollaron lesiones de neoíntima en el 27% de las arterias pulmonares seleccionadas, y la media de la puntuación de oclusión vascular fue de 0,24. La diferencia entre el grupo de HAP y el grupo de HAP + SR fue significativa (1,17±0,13 frente a 0,24±0,10; p < 0,01). Las arterias pulmonares pequeñas del grupo de control mostraron una media de puntuación de oclusión vascular de 0.

Figura 1.

Cambios representativos observados en la estructura vascular de los tres grupos. Los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina (×400). HAP: hipertensión arterial pulmonar; SR: simpatectomía renal. Los cortes se tiñeron con hematoxilina-eosina (×400).

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En la figura 2 se muestra un ejemplo de la tinción de tricrómico de Masson en los cortes de tejido. Los cortes ventriculares de los animales del grupo de HAP + SR presentaron significativamente menos fibrosis que los perros con HAP, mientras que los animales del grupo de HAP + SR presentaron más fibrosis que los perros de control. Por ejemplo, las imágenes de los corazones de animales con HAP revelaron la presencia de una gran cantidad de fibrosis (19,4 [3,8%]), mientras que en los perros de control se observó un tejido fibroso mínimo (4,1 [0,9%]) y los perros con HAP + SR presentaron un tejido fibroso moderado (11,2 [2,6%]).

Figura 2.

Cambios histológicos representativos en los tres grupos. Las áreas rojas corresponden a miocitos y las azules, a colágeno (×400). A: ejemplos del infundíbulo de salida del ventrículo derecho en los tres grupos. B: resumen de los cambios en el infundíbulo de salida del ventrículo derecho. En cambio, los cortes del ventrículo derecho de perros con hipertensión arterial pulmonar presentaron más fibrosis que los de los animales de control o con hipertensión arterial pulmonar + simpatectomía renal y tuvieron más fibrosis los perros con hipertensión arterial pulmonar + simpatectomía renal que los animales de control. HAP: hipertensión arterial pulmonar; SR: simpatectomía renal. ap < 0,01 frente a los grupos control e hipertensión arterial pulmonar + simpatectomía renal. bp < 0,01 frente al grupo de control. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

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En la figura 3 se comparan los resultados del Western blot de la arteria pulmonar en los tres grupos. Todas las mediciones de las bandas de inmunoblot se normalizaron respecto a la intensidad de la banda de actina β de la muestra cargada. Se determinaron las densidades de bandas y se realizó una cuantificación relativa de las densidades de AT1 y AT2. Tal como se muestra en las figuras 3A y B, la expresión de AT1 en la arteria pulmonar fue mayor en el grupo de HAP que en los grupos de control y de HAP + SR (1,02±0,11 frente a 0,39±0,04 y 0,38±0,05; p < 0,01). No hubo diferencias significativas en la densidad de AT2 de los tres grupos (0,44±0,04 frente a 0,41±0,05 y 0,42±0,04; p = 0,38) (figuras 3C y D).

Figura 3.

Análisis de Western blot de los receptores de angiotensina II tipo 1 y angiotensina II tipo 2 en los extractos de muestras de proteínas procedentes de la arteria pulmonar. A: ejemplos de las bandas de Western blot identificadas con los anticuerpos para el receptor de angiotensina II tipo 1. B: densidades medias de las bandas expresadas como proporciones de los tres grupos (grupo de hipertensión arterial pulmonar frente a grupo control y grupo de hipertensión arterial pulmonar + simpatectomía renal). C: ejemplos de las bandas de Western blot identificadas con los anticuerpos para el receptor de angiotensina II tipo 2. D: densidades medias de las bandas expresadas como proporciones de los tres grupos; no hubo diferencias significativas en las densidades de angiotensina II tipo 2 de los tres grupos. AT1: angiotensina II tipo 1; AT2: angiotensina II tipo 2; HAP: hipertensión arterial pulmonar; SR: simpatectomía renal. *p < 0,01.

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La HAP es una enfermedad rápidamente progresiva que conduce, en última instancia, a la insuficiencia cardiaca derecha y la muerte. Los avances realizados en el conocimiento de la biopatología a lo largo de las últimas dos décadas han conducido a tratamientos dirigidos a revertir la vasoconstricción pulmonar. A pesar de estos avances, la progresión de la enfermedad es frecuente, incluso con el empleo de pautas de tratamiento combinadas que abordan múltiples vías en su mecanismo de acción. Se ha demostrado que la presión arterial pulmonar fue atenuada por la SR en la HAP experimental. La SR puede modificar el remodelado vascular pulmonar al inhibir el sistema renina-angiotensina-aldosterona y la actividad de la ET. Los datos del presente estudio son preliminares, pero la ablación arterial renal puede ser una alternativa efectiva para el tratamiento de los pacientes con HAP. Esta observación podría plantear una preocupación respecto a la patogenia convencional de la HAP e indicar la efectividad de la SR para la HAP, un nuevo concepto similar al del efecto de la denervación arterial pulmonar para el tratamiento de los pacientes con HAP33.

El presente estudio tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, no se estudió la evolución temporal de las alteraciones hemodinámicas y estructurales inducidas por la DHMC. En consecuencia, no se sabe si el remodelado hemodinámico y estructural se inicia inmediatamente después de la inyección de DHMC y si estas alteraciones son reversibles o no. En segundo lugar, se realizó la simpatectomía renal al mismo tiempo que la inducción farmacológica de la HAP. Por consiguiente, no es posible determinar los efectos de la SR aplicada cuando la HAP está ya bien establecida, como ocurre en el contexto clínico. Sin embargo, los resultados apuntan a que la SR fue eficaz en las fases iniciales de la HAP. En futuros estudios se deberá investigar los efectos de la SR en la HAP establecida. En tercer lugar, en los animales de control y los perros con HAP, el catéter de ablación por radiofrecuencia no se colocó en las arterias renales. Los grupos de control y de HAP no fueron grupos con un tratamiento simulado real. Sin embargo, los resultados obtenidos revelaron que la SR no solo atenuó las alteraciones hemodinámicas, sino que inhibió el remodelado vascular pulmonar. Estos resultados sientan las bases para la realización de un estudio de mecanismo de acción más completo. En cuarto lugar, no se investigó en los animales de control y los tratados con SR la distribución anatómica de los nervios simpáticos periarteriales alrededor de las arterias mediante tinción de inmunofluorescencia doble con anticuerpos dirigidos a la tirosina hidroxilasa y el péptido relacionado con el gen de calcitonina. No se sabe si se destruyó o no la totalidad del plexo existente alrededor de la arteria renal. Por último, Aguero et al34 han descrito que el remodelado ventricular derecho fue estructural, histológico y molecular en un modelo de aplicación de la hipertensión pulmonar poscapilar basado en la colocación de una banda en la vena pulmonar. En el presente estudio se observó que el ventrículo derecho presentó unas cifras superiores de aldosterona, péptido natriurético tipo B y fibrosis intersticial en los perros con HAP. Sin embargo, no se investigaron los cambios de la masa ventricular derecha y los cambios moleculares en la HAP experimental producida por DHMC. Será preciso investigar con mayor detalle las alteraciones estructurales y moleculares del ventrículo derecho en la HAP experimental producida por DHMC.