INTRODUCCIÓN

En los últimos años se han producido importantes avances en el conocimiento de la aterosclerosis, enfermedad que subyace en la mayor parte de los episodios cardiovasculares. Actualmente la hipótesis más aceptada considera la aterosclerosis como el resultado de una respuesta inflamatoria de la pared a diferentes formas de lesión. El carácter crónico del proceso conduce a la formación de lesiones focales o placas que, en fases avanzadas, pueden ocluir la luz de los vasos directamente o mediante complicación trombótica 1,2.

La acumulación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el espacio subendotelial parece ser uno de los primeros episodios asociados al desarrollo de lesiones ateroscleróticas. Las LDL retenidas en la pared sufren procesos de oxidación (LDLox) y generan productos con actividad quimiotáctica para monocitos y células musculares lisas (CML). Los monocitos atraviesan el endotelio, y se diferencian a macrófagos, captan de forma masiva LDLox y se transforman en células espumosas cuya acumulación en la íntima origina la formación de la estría grasa 3. En la aterogénesis intervienen múltiples factores de crecimiento, citocinas y otras sustancias producidas por las células endoteliales, las CML, los macrófagos y los linfocitos T, que regulan la respuesta inflamatoria y la proliferación celular 4. El resultado de la interacción de estos factores es una respuesta fibroproliferativa que hace evolucionar la estría grasa a placa aterosclerótica más compleja. La rotura o ulceración de las placas inestables tiene como consecuencia la exposición de superficies procoagulantes y protrombóticas que provocan la activación de plaquetas y la formación de trombos, que pueden desencadenar complicaciones clínicas, o bien contribuir al crecimiento de la placa de forma asintomática 5. En la estabilidad de las placas desempeña un papel clave su cubierta fibrosa, formada fundamentalmente por proteínas de matriz extracelular sintetizadas por las CML como el colágeno y proteoglicanos. Las placas más vulnerables contienen un gran núcleo lipídico envuelto por una cubierta fibrosa delgada. Este núcleo se compone de material lipídico intracelular, que ha sido internalizado por macrófagos y CML, y lípido extracelular, que deriva de la retención de lipoproteínas circulantes y del liberado por las células que sufren necrosis. En la figura 1 se expone una lesión avanzada de una arteria coronaria humana donde se observan su núcleo lipídico y la presencia de un trombo parcialmente organizado que provoca, en gran medida, la oclusión del vaso.

Fig. 1. Microfotografía de una tinción con tricrómico de Masson de una sección correspondiente a una arteria coronaria humana que presenta una lesión avanzada. Se pueden apreciar el núcleo lipídico y la gran cantidad de matriz extracelular que constituye el componente mayoritario de la placa que contribuye a obstruir la luz del vaso. a: adventicia; l: lumen; m: media; ng: núcleo graso; t: trombo.



PAPEL DE LAS LIPOPROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD EN LA ATEROGÉNESIS

El colesterol se transporta en el plasma como componente de las lipoproteínas. Aproximadamente dos tercios del colesterol total son transportados por las LDL. Las concentraciones plasmáticas elevadas de LDL son un factor de riesgo para el desarrollo prematuro de aterosclerosis y cardiopatía isquémica (CI) 1,2. Recientemente, varios ensayos clínicos con fármacos hipolipemiantes, en concreto con los inhibidores del enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa (estatinas), han demostrado una estrecha relación entre los valores circulantes de LDL y el riesgo de muerte asociado a CI 6-10.

La hipercolesterolemia se asocia no sólo con un mayor depósito de lípidos en las lesiones sino que valores elevados de LDL alteran diferentes funciones tanto de las células endoteliales como de las CML y de los monocitos. Las LDL alteran la función endotelial: producen una respuesta disminuida de la dilatación dependiente de endotelio 11 y un incremento de las moléculas de adhesión, proteínas que se localizan en la membrana de las células endoteliales y funcionan como puntos de anclaje al endotelio de monocitos circulantes 12. En células endoteliales en cultivo, concentraciones aterogénicas de LDL (> 160 mg/dl) provocan cambios en el metabolismo del ácido araquidónico 13; alteran la producción de óxido nítrico (ON) y radicales libres 14,15; incrementan la expresión de moléculas de adhesión per se y la inducida por citocinas, y aumentan la adhesión de monocitos 16. En la figura 2 se esquematiza cómo la infiltración de las LDL en el espacio subendotelial y su retención por las proteínas de matriz extracelular alteran la homeostasis de la pared vascular.

Fig. 2. Esquema de los mecanismos celulares y moleculares que dan origen al inicio y progresión de las lesiones ateroscleróticas. En zonas donde existe una disfunción endotelial que facilita la infiltración de LDL al espacio subendotelial, éstas penetran, interaccionan con proteínas de matriz extracelular [MEC] y sufren procesos de modificación. Primeramente se originan LDL mínimamente modificadas (LDLmm) y posteriormente LDL con mayor grado de oxidación (LDLox). Las LDLox alteran la producción de óxido nítrico (ON) y, con ello, perturban todas las funciones protectoras del ON sobre la pared vascular. Se indica el papel protector de las HDL frente a los procesos oxidativos de las LDL, y cómo los monocitos se adhieren al endotelio activado que sobrexpresa ICAM-I y VCAM-I. Los monocitos circulantes, atraídos por las LDLox retenidas en la pared y la producción incrementada de la proteína 1 quimiotáctica para monocitos (MCP-1), penetran en la pared y son activados a macrófagos, proceso en el que también intervienen las LDLox. Los macrófagos captan LDL modificadas y se transforman en células espumosas. Las células musculares lisas (CML) de la media activadas por citocinas y factores de crecimiento liberados en las lesiones se transforman a un fenotipo sintético, migran a la íntima atraídas por factores quimiatrayentes y proliferan contribuyendo a la evolución de las lesiones.



La hipercolesterolemia activa la proliferación de CML y la expresión de la proteína-1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1) 17. Las CML en cultivo proliferan más rápidamente con suero procedente de pacientes hipercolesterolémicos que con suero de individuos normocolesterolémicos 18. Además, recientemente nuestro grupo ha demostrado que el contenido de los ácidos grasos de la dieta, que se traduce en cambios en la composición de las LDL, influye en la capacidad del suero de inducir proliferación de las CML en cultivo, y que las dietas ricas en ácido oleico son las que resultan menos proproliferativas y, por tanto, potencialmente poseen un mayor poder cardioprotector 19. Estos efectos podrían estar relacionados con la capacidad de las lipoproteínas de activar diferentes vías de transmisión de señal ligadas al estímulo mitogénico y de potenciar el efecto de los factores de crecimiento séricos.

Retención y modificación de las lipoproteínas de baja densidad en la íntima de la pared vascular

El sistema vascular se encuentra recubierto por una monocapa de células endoteliales que regulan la permeabilidad de la pared vascular a elementos celulares y macromoléculas como las LDL. El flujo de LDL a través del endotelio tiene lugar según un gradiente de concentración mediante un proceso de transcitosis que no está mediado por receptor. Ciertos factores de riesgo, como la hipertensión o la hipercolesterolemia, favorecen la penetración y la retención de las LDL en la íntima por proteoglicanos y glucosaminoglicanos, lo que favorece los procesos de modificación proteolíticos y oxidativos 20. Los principales proteoglicanos implicados parecen ser de la familia de los versicanos. In vitro, el versicán puede formar distintos tipos de complejos con las LDL, desde complejos fácilmente disociables hasta agregados insolubles, ambos tipos de complejos han sido aislados a partir de lesiones humanas 21.

La retención de las LDL en la íntima favorece el ataque de diversas enzimas que modifican las LDL e incrementan su aterogenicidad. La modificación de las LDL de la que se tiene un mayor conocimiento es la oxidación 22, en la que intervienen, en un primer momento, las células endoteliales y, posteriormente, las CML y los macrófagos. En primer lugar se generan unas LDL, que se han denominado mínimamente modificadas (LDLmm), que presentan un grado de oxidación relativamente bajo, pero que activan el endotelio y poseen mayor capacidad que las LDL nativas de inducir la adhesión de monocitos 23,24. En la figura 3 se observa que las LDLmm producen más adhesión de monocitos a las células endoteliales en cultivo que las LDL nativas. Varios sistemas enzimáticos, como la mieloperoxidasa y las lipooxigenasas, muy activos en los macrófagos, se han implicado en la oxidación de las LDL 25. La oxidación de las LDL puede ser potenciada por procesos patológicos subyacentes como la diabetes, ya que concentraciones elevadas de glucosa promueven la glucosilación y aceleran la oxidación 26.

Fig. 3. Efecto de las LDL con diferente grado de oxidación sobre la adhesión de monocitos a células endoteliales en cultivo. Células endoteliales de vena de cordón umbilical (HUVEC) se expusieron durante 24 h a 180 mg/dl de LDL nativas (LDLn), LDL mínimamente modificadas por oxidación (LDLmm), o LDL sometidas al mismo proceso de modificación que las LDLmm, pero en presencia de un antioxidante (LDL-U74500A y LDL-BHT), y posteriormente se analizó la capacidad de adhesión de la línea monocítica U937 a estas células endoteliales. Se presentan los resultados de 5 experimentos independientes realizados en triplicado. Se observa que las LDL que poseen mayor grado de oxidación, LDLmm y LDL-BHT (proporcional al nivel de MDA/ml mostrado en A), inducen más adhesión de los monocitos a las células endoteliales (B). p < 0,05: +, frente a control; +, frente a HUVEC tratadas con LDLmm; #, frente a HUVEC tratadas con LDLBHT. (Modificada de Colomé et al, 2000.)



En los últimos años se han acumulado evidencias que indican que la oxidación de las LDL desempeña un papel clave en el proceso de acumulación de material lipídico en las placas 22. Las LDLox intervienen prácticamente en todas las etapas del proceso de formación de lesiones: inducen la expresión de MCP-1 27 y de moléculas de adhesión como la molécula 1 de adhesión vascular (VCAM-1) y la P-selectina en células endoteliales, lo que facilita la unión de monocitos circulantes al endotelio 28; provocan apoptosis de las células endoteliales 29 y alteran la producción de ON y radicales libres, con el consiguiente deterioro de la protección antiaterogénesis que ejerce el endotelio 30. Recientemente se ha clonado un receptor para las LDLox denominado lectin-like ox-LDL receptor-1 (LOX-1), cuya expresión se encuentra aumentada en lesiones ateroscleróticas humanas y que podría mediar estos efectos 31.

Las LDLox tambien promueven la diferenciación de monocitos a macrófagos, y modulan la activación en estas células de factores como el factor nuclear kappa B (NF- kB) 32. Además del estrés oxidativo, el NF- kB es activado por diversos estímulos inflamatorios como citocinas, patógenos microbianos y virus. La activación de este factor se ha detectado tanto en macrófagos como en células endoteliales y CML de lesiones ateroscleróticas 33. A diferencia de otros factores de transcripción, la activación del NF- kB no requiere inducción de su expresión. Este factor se encuentra en forma de heterodímero inactivo en el citoplasma unido a proteínas inhibidoras denominadas genéricamente I kB. El heterodímero típico del NF- kB consiste en una subunidad p50 y otra p65. Cuando la célula es estimulada por alguno de los agentes mencionados anteriormente, I kB se fosforila y experimenta ubiquitinación, lo que sirve de «señal» para que sufra degradación proteolítica. Entonces, el dímero p50/p65 se transloca al núcleo, donde activa la transcripción de genes diana que poseen en su promotor elementos de respuesta kB (fig. 4). Entre los numerosos genes regulados por NF- kB se encuentran citocinas [factor necrosante de tumores (TNF a), interleucinas (IL)-1,-6 y -8], factores estimuladores de la formación de colonias de granulocitos/macrófagos (G-CSF, M-CSF, GM-CSF), MCP-1, el factor tisular, varias moléculas de adhesión (ICAM-1, VCAM-1) y c- myc34-36. Por tanto, la activación del NF- kB parece ser un punto clave en la activación de múltiples efectos ligados al proceso aterosclerótico. Recientemente, su activación en leucocitos circulantes se ha asociado con la angina inestable y, dado que dicha activación puede detectarse antes de un episodio clínico, se ha postulado que podría estar involucrado en la rotura de las placas que producen los síndromes coronarios agudos 37.

Fig. 4. Activación del factor NF-kB por diferentes agentes y modulación por dicho factor de la expresión de diferentes genes diana.



PAPEL DE LOS DISTINTOS TIPOS CELULARES DE LA PARED VASCULAR EN LA ATEROSCLEROSIS

Papel del endotelio: disfunción endotelial

El endotelio integra diversas funciones reguladoras que contribuyen a mantener la homeostasis de la pared vascular. Se ha denominado disfunción endotelial cualquier alteración de la fisiología del endotelio que produzca una descompensación de dichas funciones. El endotelio regula factores que, en algunos casos, operan antagónicamente. El endotelio regula el tono vascular mediante la producción de moléculas vasodilatadoras como el ON y la prostaciclina, y de sustancias vasoconstrictoras como la endotelina y la angiotensina II 38. El endotelio posee también propiedades antitrombóticas gracias a que, en su cara luminal, el heparán se asocia a la antitrombina III y la activa, con lo que previene la activación de la trombina 39. Por tanto, una disfunción endotelial puede producir una perturbación del balance entre los agentes vasoactivos o entre sus funciones pro y antitrombogénicas, con el consiguiente incremento de la adhesión de plaquetas. En la figura 5 se ilustra la alteración por concentraciones aterogénicas de LDL de los valores de expresión de la enzima NOS de células endoteliales (eNOS o NOS III), principal enzima reguladora de la producción de ON en el endotelio 40. El endotelio expresa además proteínas de membrana que actúan como moléculas de adhesión para receptores específicos de monocitos y linfocitos T. Estas moléculas son selectinas como la E- y la P-selectina, denominadas así por su similitud estructural a las lectinas, y proteínas pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas como VCAM-1 y las moléculas 1, 2 y 3 de adhesión intercelular (ICAM-1, 2 y 3) 41. El endotelio activado por agentes proinflamatorios expresa valores más elevados de estas moléculas de adhesión y de sustancias quimioatrayentes, lo que facilita la unión y migración de monocitos. El dominio extracelular de estas moléculas de adhesión puede fácilmente liberarse al torrente circulatorio; por ello, en la actualidad se evalúa la validez de los valores de los fragmentos solubles de estas moléculas como marcadores de evolución de las lesiones ateroscleróticas y procesos patológicos asociados 42,43.

Fig. 5. Efecto de concentraciones crecientes de LDL nativas (mg/dl) sobre los valores de ARNm de eNOS de células endoteliales en cultivo, analizados mediante Northern blot. En la parte inferior, donde se presenta la tinción del gel con bromuro de etidio, se aprecian los valores de ARN ribosomal (rARN) 28S utilizados como control de carga del experimento. (Modificada de Vidal et al, 1997.)



Son múltiples los factores que pueden provocar una disfunción endotelial. Los más estudiados incluyen sustancias inmunorreguladoras como el TNF- a y la IL-1 b, toxinas bacterianas como el lipopolisacárido y, sobre todo, el colesterol y las LDLox. En cultivos de células endoteliales se ha comprobado que las LDLox producen una disminución de la expresión de los títulos de mARN y de proteína de la enzima eNOS 29. El ON liberado por el endotelio no sólo contribuye a mantener el tono arterial, sino que también evita la proliferación de las CML, disminuye la adhesión de monocitos y la agregación de plaquetas, y preserva de la oxidación a las LDL 44. Por tanto, la disminución dela liberación de ON potencia el daño endotelial y facilita la proliferación de las CML inducida por mitógenos. En cambio, la sobreproducción de ON mediante un sistema experimental de transferencia génica in vivo, consistente en la sobrexpresión de la enzima eNOS mediante un vector adenovírico, bloquea eficazmente la formación de neoíntima inducida mediante dilatación con balón en el modelo porcino 45. La importancia de esta enzima en la enfermedad cardiovascular la corroboran diferentes estudios que encuentran una asociación entre determinadas variantes polimórficas del gen de la eNOS, tanto en regiones codificantes como en la región promotora, con un mayor riesgo de enfermedad coronaria 46 o de espasmo coronario 47.

El endotelio también desempeña un papel clave en el proceso de angiogénesis que tiene lugar en las placas ateroscleróticas. En este proceso, se requieren la migración y proliferación de las células endoteliales para generar nuevos vasos en el interior de las lesiones. La angiogénesis es activada por diferentes factores, como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF), cuya expresión aumenta en respuesta a ciertas condiciones desencadenantes del proceso como la hipoxia 48,49. El VEGF es un factor angiogénico mitógeno para las células endoteliales, que aumenta la permeabilidad vascular y modula la trombogenicidad 50. El VEGF estimula la liberación por parte de las células endoteliales de prostaciclina y ON, y a su vez el ON parece que actúa como un regulador endógeno que reduce la expresión del VEGF en la pared vascular 51. Además de estos factores, que son generados in situ por las células que interaccionan en las lesiones ateroscleróticas, la trombina retenida por la matriz extracelular, donde permanece funcionalmente activa, parece desempeñar un papel clave en la regulación del proceso. La trombina posee actividad mitogénica para las células endoteliales 52 y modula la actividad de metaloproteasas que degradan la matriz extracelular y facilitan la migración celular 53.

Papel de los monocitos/macrófagos

Debido al carácter de respuesta inflamatoria-fibroproliferativa crónica del proceso aterosclerótico, los monocitos y linfocitos T tienen un papel clave tanto en su génesis como en la progresión de las lesiones. Uno de los episodios más tempranos en la formación de lesiones ateroscleróticas es la adhesión de monocitos circulantes al endotelio y su migración a la íntima 4. El aumento de la unión de monocitos al endotelio parece deberse a un incremento de la expresión, por parte del endotelio activado, de alguna de las moléculas de adhesión mencionadas anteriormente, que son inducidas por agentes proaterogénicos como citocinas o las LDLox. Los monocitos adheridos al endotelio penetran en la íntima, atraídos por las LDLox y otras sustancias quimiotácticas sintetizadas por el endotelio activado, como el MCP-1 26. En la adhesión de los monocitos a la pared se ha propuesto un modelo según el cual una primera interacción lábil entre el monocito y el endotelio se produciría a través de las selectinas. En el endotelio activado, la sobrexpresión de VCAM-1 e ICAM-1 permitiría la unión más estable de los monocitos a través de receptores específicos. Por ejemplo, VCAM-1 se une específicamente a very late antigen-4 (VLA-4) de los monocitos, que es un receptor perteneciente a la subfamilia b 1 de las integrinas. Posteriormente, el monocito atraviesa el endotelio a través de los espacios intercelulares donde participan otras proteínas especializadas como la molécula de adhesión plaquetar-1 (PECAM-1).

La activación en la íntima de los monocitos a macrófagos es estimulada por las LDL modificadas y diferentes moléculas producidas por los linfocitos T, las células endoteliales y las CML. Los linfocitos T producen interferón- g (INF-g) y TNF- a, que activan los monocitos, así como factores estimuladores de la formación de colonias como el GM-CSF, que estabilizan los macrófagos y estimulan su proliferación 4. En ratones Knock-out para INF- gse ha observado que la carencia de este gen protege contra la aterosclerosis. Los ratones deficientes en INF- g presentan lesiones más ricas en colágeno y de menor contenido lipídico 54.

Captación de LDL modificadas:receptoresscavenger

Uno de los procesos clave en el desarrollo de las lesiones ateroscleróticas es la captación de LDL modificadas por los macrófagos. Los macrófagos poseen la capacidad de captar LDL modificadas en grandes cantidades y de convertirse en células espumosas 3. La acumulación de células espumosas en la íntima conduce a la formación de la denominada estría grasa. La estría grasa corresponde a la lesión tipo II en la clasificación aceptada por la American Heart Association, que categoriza las lesiones ateroscleróticas en VIII fases o estadios 55.

La interacción de las LDL con los proteoglicanos de la íntima favorece los procesos de modificación y agregación de las LDL. En la agregación de las LDL parece que desempeñan un papel importante otros factores como la fuerza de cizalladura, y actividades enzimáticas como la fosfolipasa A 2 y la esfingomielinasa 56,57. Las LDL agregadas (LDLag) aisladas de las lesiones ateroscleróticas son captadas ávidamente por macrófagos en cultivo mediante fagocitosis 58,59, mientras que las LDLox se captan a través de los receptores scavenger. Ninguno de estos mecanismos de captación de LDL está regulado por la concentración intracelular de colesterol, por lo que se produce acumulación de colesterol en los macrófagos y CML. Los receptores scavenger mejor caracterizados son los tipos I y II de la clase A, que han sido clonados en diferentes modelos animales y en humanos 60. Estos receptores funcionan como proteínas de membrana homotriméricas. Cada monómero posee 6 dominios estructurales. Mediante estudios de mutagénesis dirigida se ha podido establecer que la región colageno-like, que posee una elevada carga positiva, constituye la región de unión a las LDLox. Además de la oxidación, cualquier modificación de las LDL que aumente su carga negativa posibilita su captación por este tipo de receptores, por ejemplo, la glucosilación no enzimática producida por concentraciones de glucosa en sangre asociadas a la diabetes 61. En la tabla 1 se indican algunos de los receptores para lipoproteínas nativas y modificadas expresados por las células de la pared vascular sana y en las lesiones ateroscleróticas

El colesterol libre es citotóxico, por lo que las células lo reesterifican por medio de la enzima aciltransferasa y lo acumulan, junto con triglicéridos y fosfolípidos, en el interior de vacuolas. Sin embargo, la capacidad de las células de acumular el colesterol es limitada. La formación de centros necróticos en las placas ateroscleróticas se atribuye precisamente a la lisis de células espumosas que han saturado su capacidad de neutralizar el colesterol libre por esta vía 64.

Degradación de la cubierta fibrosa por los macrófagos

La aterosclerosis puede contemplarse como un proceso inflamatorio crónico. Una característica fundamental de cualquier respuesta inflamatoria es la actividad de enzimas con capacidad de degradar el tejido conectivo extracelular. En este proceso se atribuye un papel muy activo a los macrófagos que producen enzimas que degradan el tejido conectivo, como las metaloproteasas (colagenasa intersticial, gelatinasas y estromelisina) 65. Las placas, de localización normalmente excéntrica, son más vulnerables a sufrir rotura o ulceración en las zonas de unión a la pared, región definida como el hombro de la placa 66. Estas áreas contienen pocas CML; en cambio, en ellas abundan los macrófagos y linfocitos T, que secretan factores como TNF- a o IL-1 b, los cuales activan la producción de metaloproteasas por parte de las CML y, sobre todo, los macrófagos 67. La destrucción de la matriz extracelular por estas enzimas que degradan colágeno y proteoglicanos debilita la cápsula fibrosa de las placas y contribuye a su inestabilización y rotura.

En animales de experimentación se ha comprobado que, al disminuir las concentraciones plasmáticas de LDL mediante la dieta o fármacos hipolipemiantes, se reduce la cantidad de macrófagos en las lesiones y, por tanto, también disminuye la expresión de metaloproteasas que degradan la matriz extracelular 68 y otros marcadores de inflamación expresados por los macrófagos como la NOS inducible (iNOS o NOS II) 69-71, cuya expresión se ha asociado con un incremento del estrés oxidativo en las lesiones 72.

Papel de las células musculares lisas

Las CML son el componente celular mayoritario de las lesiones ateroscleróticas iniciales, donde puede alcanzar hasta el 90% del contenido celular 73, y también de la neoíntima de placas reestenóticas 74. En cambio, en las lesiones avanzadas la fracción de CML que presenta marcadores de proliferación celular activa (p. ej., el antígeno nuclear de células proliferantes -PCNA-) es inferior al 1% 75. En las lesiones avanzadas predomina la matriz extracelular sobre las CML, por lo que actualmente se cuestiona la relevancia de la proliferación de las CML en la aterosclerosis y se especula sobre el papel protector que pueden ejercer, sobre todo por la capacidad de las CML de sintetizar proteínas de matriz extracelular, principal componente de la cubierta fibrosa de las placas.

Las CML de la capa media son activadas por moléculas secretadas por el resto de células presentes en las lesiones ateroscleróticas 4, con lo que sufren una transformación fenotípica: CML de fenotipo contráctil no proliferativo se transforman en células que proliferan activamente, que migran atraídas por agentes quimiotácticos y que producen proteínas de matriz extracelular (colágeno, elastina y proteoglicanos). Esta transformación activa la expresión de genes que codifican receptores de membrana para factores de crecimiento como el PDGF. Además, se estimula la producción de factores de crecimiento (PDGF, IGF-I, etc.) y citocinas (TGF b, IL-1, etc.), a través de los cuales las CML modulan su propia actividad y la de otras células que intervienen en la aterogénesis. En la figura 6 se resumen algunos de los factores de crecimiento, citocinas y otras moléculas por medio de los cuales se modulan entre sí las actividades de las CML, células endoteliales y monocitos/macrófagos.

Fig. 6. Activación de las células musculares lisas (CML) por factores de crecimiento, citocinas y otras moléculas sintetizadas por diferentes células que participan en la aterogénesis (células endoteliales, plaquetas, células musculares lisas, linfocitos T y macrófagos). Se indican algunos de los factores de crecimiento, citocinas y macromoléculas cuya síntesis se ve afectada en el proceso de activación de las CML.



La rotura de una placa aterosclerótica espontánea, o provocada por una técnica de revascularización como la angioplastia, ocasiona la pérdida de los elementos antitrombóticos del endotelio, como el ON y la PGI 2, además de la exposición de estructuras de la pared que producen la formación de trombos 5. Las plaquetas al agregarse liberan el contenido de sus gránulos ricos en mitógenos, como PDGF y el EGF, que inducen la migración y proliferación de las CML. Utilizando modelos animales, sobre todo el modelo porcino, se ha establecido que en los primeros días (1 a 4) se producen hipertrofia y cierta proliferación de las CML en la media. Posteriormente las CML migran a la íntima, donde proliferan activamente 76.

Activación de las células musculares lisas en la media y migración a la íntima

La migración de las CML es controlada de forma redundante por un conjunto de moléculas como el bFGF, PDGF, EGF, la trombina, la angiotensina II y otras 4. Estos mitógenos inducen la expresión de proteasas que degradan la matriz extracelular, como la plasmina y metaloproteasas. La actividad de estas enzimas, cuya expresión se encuentra incrementada en las lesiones ateroscleróticas, facilita la migración de las CML. Por otra parte, el balance local entre la actividad del activador del plasminógeno tisular (t-PA) y del inhibidor-1 de dicho activador (PAI-1) puede repercutir en el proceso de migración de las CML y de síntesis/degradación de matriz extracelular y, por consiguiente, en la evolución de las lesiones. Los títulos de PAI-1 están incrementados en las placas ateroscleróticas, sobre todo debido a una producción aumentada por parte de las CML 77. Una proteólisis mural aumentada puede potenciar la migración y proliferación de las CML. De hecho, al inducir lesiones intravasculares en animales deficientes en PAI-1, se observan un incremento de la migración de las CML y un mayor desarrollo de neoíntima, procesos que son inhibidos al sobrexpresar localmente PAI-1 mediante vectores adenovíricos 78. Además, la plasmina participa en la activación de metaloproteasas que degradan la matriz extracelular 77 y del TGF- b, que es una citocina pluripotencial sintetizada en forma de zimógeno inactivo, que entre otras funciones estimula la producción de matriz extracelular 4.

Proliferación de las células muscualres lisasen la íntima y síntesis de matriz extracelular

Estudios realizados en diferentes modelos animales indican que el PDGF es clave en la proliferación de las CML en la íntima. La sobrexpresión de PDGF en la pared arterial, inducida in vivo con vectores plasmídicos, produce el engrosamiento extraordinario de la íntima 80. Además, anticuerpos anti-PDGF bloquean la formación de neoíntima en el modelo de angioplastia en aorta de rata 81. La pérdida del endotelio producida por una lesión vascular hace que persista, durante varias semanas, la interacción de plaquetas con la pared, lo que produce una liberación permanente de PDGF. Con la pérdida del endotelio, desaparece la inhibición que en condiciones normales ejerce el ON sobre la proliferación de las CML. Además del PDGF, otros agentes como la trombina y la angiotensina II promueven la proliferación de las CML. La trombina, que se genera en grandes cantidades en los focos de trombosis (< 130 nmol/l) 82, actúa como agente hipertrófico e induce la proliferación de las CML 83. Los trombos murales pueden actuar como reservorio de trombina 84; además, en las placas ateroscleróticas se ha detectado un aumento del número de receptores para la trombina en las CML y los macrófagos, lo que potencia su capacidad de respuesta 85. La trombina y la angiotensina II también facilitan la acumulación de matriz extracelular, ya que activan la producción de PAI-1 y reducen la lisis de las proteínas de matriz por la plasmina 86.

El TGF- b, producido en lesiones ateroscleróticas sobre todo por los monocitos/macrófagos, induce la síntesis de matriz extracelular por las CML 4. Se ha observado que la sobrexpresión de esta citocina en la pared vascular, mediante la transferencia de plásmidos de expresión encapsulados en liposomas, produce engrosamiento de la íntima por la acumulación masiva de colágeno secretado por las CML 87.

Inducción de genes ligados a la activación de las células musculares lisas

Tanto en las CML en cultivo como in vivo en modelos animales en los que se induce lesión en la pared, la proliferación de las CML no comienza hasta transcurridos 1 o 2 días de la exposición a mitógenos o inducción de lesión. Sin embargo, los mecanismos moleculares que activan las CML tienen lugar de forma inmediata 76. Los mitógenos inducen la expresión de genes que se expresan débilmente o no se expresan en las CML en estado quiescente (no proliferativo), y cuyo mensaje es necesario para completar el ciclo celular. En primer lugar (transición de fase G 0/G 1), se induce la expresión de los llamados «genes de respuesta inmediata», que incluyen protooncogenes como c- fos, c- jun y c- myc88; la ciclooxigenasa-2, que es un gen marcador de respuesta inflamatoria 89, y otros como el MCP-1, que actúa como sustancia quimioatrayente para monocitos, o la trombospondina 90. A medida que las CML progresan en el ciclo celular, se inducen otros genes como el PCNA, que es una apoproteína que actúa como cofactor del ADN polimerasa delta, enzima necesaria para la síntesis de ADN, y c- myb otro protooncogén homólogo al gen transformador del virus de la mieloblastosis aviar 91. La expresión máxima de la mayoría de los genes de inducción temprana se alcanza entre las 2 y las 6 h posteriores a la inducción, tanto en células en cultivo como en experimentos in vivo en el modelo porcino 92. En el caso de c- fos, la expresión es más transitoria, alcanza un máximo entre 30 y 45 min, y al cabo de 2 h sus valores descienden a los basales. En la figura 7 se presenta el efecto del tiempo en la inducción de c- fos en CML humanas estimuladas con distintos factores de crecimiento potencialmente implicados en la aterogénesis.

Fig. 7. Inducción de la expresión de c-fos en CML humanas en cultivo a los 30 min de estímulo con concentraciones crecientes de diferentes inductores. Los valores de mARN de c-fos y del ARN ribosomal (rRNA) utilizados como control se analizaron mediante la técnica de Northern blot. PDGF-BB: dímero BB del factor de crecimiento derivado de plaquetas; EGF: factor de crecimiento endotelial; PMA: 4-b-forbol-12-miristato-13-acetato (éster de forbol). (Modificada de Martínez-González et al 1997.)



El número de genes vinculados a la activación de las CML es, en realidad, más amplio y aumenta a medida que la tecnología del ADN recombinante se ha aplicado sistemáticamente para aislar genes involucrados en este proceso. Recientemente, nuestro grupo ha comunicado el aislamiento y caracterización de un nuevo gen (Nor-1) que se induce, en las CML estimuladas con suero, PDGF y trombina 93. Este gen se ha implicado en procesos de apoptosis y migración celular en otros sistemas celulares 94,95, por lo que potencialmente podría estar involucrado en la regulación de la población de CML en lesiones ateroscleróticas, proceso que resulta clave tanto en la evolución como en la estabilización de las lesiones.

Para que se produzca la inducción de la expresión de los genes ligados a la activación de las CML, es necesario que el estímulo que aporta el mitógeno en la membrana celular se transmita a la maquinaria que regula la transcripción en el núcleo. La mayor parte de los factores de crecimiento actúan sobre las CML a través de receptores específicos pertenecientes a la familia de receptores tirosincinasa que activan la vía de las cinasas dependientes de mitógenos (MAP cinasas) a través de Ras 96. Los receptores tirosincinasa poseen un dominio extracelular que confiere la especificidad de ligando; un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático con actividad tirosincinasa. Cuando se une un factor de crecimiento a su receptor, éste se autofosforila en residuos de tirosina del dominio citoplasmático. Estos residuos tirosina fosforilados son un blanco para proteínas citoplasmáticas como Grb2, que actúa como conector con Sos, que es una molécula que estimula el intercambio de nucleótidos de Ras. Ras es una proteína que se une a la membrana plasmática mediante grupos isoprenoides (farnesilo) y que, en estado inactivo, está unida a GDP. La unión Grb2-Sos activa Ras mediante el intercambio de GDP por GTP. Ras activado desencadena una cascada de fosforilación a través de Raf, que transmite la señal, mediante la vía de las MAP cinasas hasta el núcleo, donde se promueve la expresión de factores de transcripción que controlan el proceso de proliferación celular. El proceso es en realidad más complejo, porque normalmente se activan vías paralelas en las que participan otras proteínas; sin embargo, la vía común en la que confluyen diferentes señales parece ser la vía de las MAP cinasas dependientes de Ras 97. En el sistema cardiovascular esta vía es activada, además de por mitógenos, por citocinas y por inductores de estrés e hipertrofia 98.

Formación de células espumosas a partir de células musculares lisas

Las CML que proliferan activamente tienen una gran capacidad de sintetizar proteoglicanos que, al interaccionar con las LDL, favorecen su agregación y captación por las CML y macrófagos 99,100. Las CML activadas expresan receptores scavenger a través de los cuales captan LDL modificadas 101 y dan origen a células espumosas 59. Nuestro grupo ha demostrado que las CML también captan las LDLag a través del low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) 102 y acumulan cantidades significativas de ésteres de colesterol, considerados un marcador de formación de célula espumosa 103. En la figura 8A se observa la colocalización en las CML de LDLag marcadas con un producto fluorescente y LRP marcado con un anticuerpo específico. LRP es un receptor endocítico multifuncional de 600 kDa que pertenece a la familia de los receptores de LDL y que es altamente expresado en las CML de pared vascular (tabla 1). El receptor activo consta de dos cadenas: una de unión a ligandos (cadena a) y otra de anclaje en la membrana (cadena b) 104. El LRP une distintos ligandos que incluyen lactoferrina, trombospondina, distintas lipoproteínas plasmáticas tales como VLDL, LpL, complejos LpL-lipoproteínas ricas en triglicérido y Lp (a). Puesto que el LRP está altamente expresado en CML y que este receptor no está regulado por las concentraciones intracelulares de colesterol, el LRP puede considerarse un mecanismo de alta capacidad/baja especificidad que permite la captación por las CML de una gran cantidad de LDLag. Las LDL modificadas in vitro por agregación son similares en estructura a las que se han encontrado en las lesiones ateroscleróticas 105,106. La retención y agregación de la LDL subendotelial son procesos clave en la aterogénesis y, puesto que el LRP está altamente expresado en las lesiones ateroscleróticas 62,63,107, la captación de LDL modificada por agregación a través del LRP podría tener un papel significativo en la acumulación intracelular de lípido en CML en placas ateroscleróticas.

Fig. 8. Colocalización de LDL modificada por agregación y low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) en células musculares lisas (CML). Fotografías de microscopia confocal de CML incubadas con anticuerpos anti-LRP (cadena b) (en verde) y con 50 µg/mL de LDL agregadas (A) o nativas (B) marcadas con el marcador fluorescente 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI) (en rojo) (magnificación ´5.000). (Modificada de Llorente-Cortés et al, 2000.)