Se reclutó para el estudio en la clínica ambulatoria del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona a un total de 43 pacientes diabéticos de atención primaria (varones y mujeres), de entre 41 y 73 años de edad, tratados según lo establecido en las guías internacionales. Los pacientes incluidos en el estudio tenían DM1 y DM2 y los criterios de exclusión fueron: toma de AAS o ibuprofeno en los últimos 10 días, contraindicaciones para el empleo de AAS o bloqueadores beta, úlcera péptica, aumento del riesgo hemorrágico y antecedentes de cáncer, trastornos inflamatorios, sepsis, infección o embarazo.

El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética de investigación del hospital, y el ensayo se llevó a cabo según la Declaración de Helsinki. Todos los participantes dieron su consentimiento por escrito para la participación en el estudio. Después del examen de selección y la inclusión en el estudio, se realizó una historia clínica para registrar los datos de estilo de vida, médicos y terapéuticos, así como las determinaciones basales. A continuación, los pacientes iniciaron el periodo de intervención, durante el cual se les administraron 100mg de AAS diariamente durante 10 días. Se realizaron extracciones de sangre antes (situación basal) y después del periodo de intervención con AAS.

Con objeto de asegurar la adherencia al tratamiento con AAS y su eficacia, se verificó la inhibición de la ciclooxigenasa 1 y se determinó la inhibición de la formación de tromboxano B2 mediante un kit comercial de enzimoinmunoanálisis (Thromboxane B2 Express Eia Kit-Monoclonal, Cayman Chemical) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Como sujetos de control, se incluyó a 38 participantes con un riesgo CV moderado-alto, que no presentaban DM ni ECV, igualados en las variables sexo, edad, factores de riesgo CV clásicos y uso de estatinas. Se reclutó a los controles a partir de la cohorte SAFEHEART22, un estudio multicéntrico de larga duración prospectivo y abierto. Ninguno de los participantes del grupo de control estaba en tratamiento con AAS. Mediante un formulario estandarizado, en el momento de la inclusión se obtuvieron de todos los participantes datos relativos a las características demográficas y clínicas, los antecedentes CV, los factores de riesgo CV clásicos y el tratamiento actual para la hipercolesterolemia.

Se extrajeron muestras de sangre de la vena cubital, sin aplicar torniquete, utilizando una aguja de calibre 20, después de 10-14 h en ayunas, y se colocaron en tubos con citrato de sodio al 3,8%. Se retiraron las células sanguíneas mediante centrifugación a baja velocidad (250 × g, 15 min) a temperatura ambiente, con objeto de evitar la activación plaquetaria in vitro. Se realizó una cuidadosa aspiración del plasma rico en plaquetas, dejando una capa inalterada de alrededor de 0,1 cm por encima de las células. Se realizó una segunda centrifugación (11.000 × g, 10 min, a temperatura ambiente) con objeto de asegurar que se eliminaban por completo las células y las plaquetas, para obtener un plasma con depleción de plaquetas. Se aplicó una tercera etapa de centrifugación (11.000 × g, 2 min, a temperatura ambiente) con objeto de asegurar la eliminación completa de las plaquetas y obtener un plasma sin plaquetas. Todas las muestras se procesaron de manera idéntica y en un plazo de 60 min tras la extracción. Las muestras de plasma sin plaquetas de 250 μl se congelaron de inmediato en nitrógeno líquido y se conservaron a –80°C hasta su procesamiento para aislar y cuantificar las MPc.

Se aisló la fracción de MPc del plasma sin plaquetas mediante una centrifugación a alta velocidad en dos etapas. Resumidamente, se descongelaron muestras de 250 μl de plasma sin plaquetas congelado, manteniéndolas en hielo en proceso de fusión durante 1 h, y se centrifugaron a 20.000 × g durante 30min a 30°C para la sedimentación de las MPc. Se desecharon los sobrenadantes y se lavó el sedimento enriquecido en MPc con solución salina tamponada con citrato-fosfato (fosfato 1,4 mmol/l; NaCl 154 mmol/l; citrato trisódico 10,9 mM, y pH 7,4) antes de una segunda etapa de centrifugación de las mismas características. Por último, se resuspendieron los sedimentos de MPc restantes en 100 μl de solución tamponada de citrato-fosfato.

Se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo de triple marcado, según lo descrito por Suades et al23. De manera resumida, se diluyeron 5 μl de suspensiones de MPc lavadas en 30 μl de solución salina tamponada con fosfato, con un contenido de CaCl2 2,5 mM (tampón de unión de anexina). A continuación, se agregaron combinaciones de 5 μl de AV conjugada con V450 (BD-horizon) con dos anticuerpos monoclonales específicos (mAc) (5 μl de cada uno) (tabla 1), marcados con isotiocianato de fluoresceína o ficoeritrina, o con anticuerpos de control isotípico. Las muestras se incubaron a oscuras durante 20 min a temperatura ambiente y se diluyeron con el tampón de unión de anexina antes de analizarlas de inmediato en un citómetro de flujo FACSCantoIITM (excepto en el caso de las micropartículas derivadas de células de músculo liso). Las micropartículas derivadas de células de músculo liso se cuantificaron por separado según un método descrito con anterioridad14. Resumidamente, se incubaron a oscuras 5 μl de la suspensión de MPc durante 20 min a temperatura ambiente, con 5 μl de AV-V450 y 5 μl de CD142-(factor tisular [FT])-isotiocianato de fluoresceína en un volumen final de 50 μl de tampón de unión de anexina. Las MPc se fijaron con 450 μl de tampón de unión de anexina/paraformaldehído al 2% durante 30 min y se centrifugaron a 20.000 × g durante 30 min para sedimentar las MPc. Después de eliminar el sobrenadante, las MPc se permeabilizaron con 20 μl de tampón de unión de anexina/saponina al 0,1% durante 20 min a temperatura ambiente y a oscuras. Tras la permeabilización, se añadieron 5 μl de actina de músculo liso-α-ficoeritrina a la suspensión de MPc y se incubó a oscuras durante 20 min a temperatura ambiente, y finalmente se diluyó con tampón de fijación de anexina antes de los análisis con el citómetro de flujo.

La adquisición se llevó a cabo a 1 min por muestra. Se obtuvieron datos de dispersión frontal, dispersión lateral y fluorescencia en una escala logarítmica. Las MPc se identificaron y cuantificaron en función de sus características de dispersión frontal/dispersión lateral, según su tamaño, la unión a la AV y la reactividad contra mAc para células específicas (figura 1).

Figura 1.

Estrategia de selección y adquisición para la detección de las micropartículas circulantes en el análisis FACS. Se establecieron los límites de selección antes de los análisis mediante el Flow Check YG Size Range Calibration Kit (Polysciences; Warrington, Pensilvania, Estados Unidos). G1 se fijó según el tamaño de las micropartículas circulantes y su granularidad (definida como < 1 μm). Se seleccionaron las micropartículas anexina V+ circulantes cuantificadas en el canal Pacific Blue (P1) de G1. Se seleccionaron las micropartículas circulantes unidas a los anticuerpos marcados con isotiocianato de fluoresceína (P2) y/o ficoeritrina (P3) (véase la tabla 1) de P1 y se cuantificaron. FITC: isotiocianato de fluoresceína; FSC: dispersión frontal; PE: ficoeritrina; SSC: dispersión lateral.

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La contribución de los granulocitos se infirió restando los agranulocitos (linfocitos más monocitos) del total de leucocitos, en vez de marcación con mAc específicos. Se establecieron los límites de aceptación siguiendo los criterios descritos con anterioridad23. El límite inferior de detección se estableció como umbral por encima del ruido electrónico de fondo del citómetro de flujo. Para identificar los eventos con tinción positiva, también se establecieron umbrales basados en las muestras incubadas con la misma concentración final de anticuerpos de control isotípico, tras los experimentos de titulación. El nivel de fijación de AV se corrigió respecto a la autofluorescencia utilizando señales de fluorescencia obtenidas con micropartículas en solución salina tamponada con fosfato y carente de calcio.

Los datos se analizaron con el programa informático FACSDivaTM (versión 6.1.3, Becton Dickinson). La concentración de MPc (número de MPc por microlitro de plasma sin plaquetas) se determinó mediante fórmula de Nieuwland15, con base en el volumen de la muestra, el caudal del citómetro de flujo y el número de eventos positivos para fluorescencia (N), de la siguiente manera: MPc/μl = N × (Vf / Va) × (Vt / FR) × (1 / Vi) [donde Vf (μl) es el volumen final de suspensión de MPc lavadas, Va (μl) es el volumen de suspensión de MPc lavadas utilizado para cada análisis de marcación, Vt (μl) es el volumen total de suspensión de MPc antes del análisis por citometría de flujo, FR (μl/min) es el caudal del citómetro de flujo en el modo de funcionamiento bajo (volumen medio de suspensión de micropartículas analizado en 1 min), 1 es la unidad de volumen en microlitros, y Vi (μl) es el volumen original de plasma utilizado para el aislamiento de las micropartículas. Se determinó el caudal de flujo antes de cada experimento. Con objeto de reducir el ruido de fondo, los tampones se prepararon el mismo día y se filtraron mediante filtros con poros de 0,2 μm en condiciones de baja presión por vacío.

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS Statistical Analysis System (versión 22.0). Se utilizó estadística descriptiva [media ± desviación estándar o n (%)] para describir las características basales de los pacientes y las variables de valoración de los resultados. Para el análisis de los cambios aparecidos tras el tratamiento con AAS, se utilizó una prueba de la t de Student bilateral para muestras apareadas con los datos obtenidos antes y después de la intervención. Se utilizó un análisis de varianza de una vía para comparar las diferencias existentes en los cambios de las variables de valoración en función del tipo de DM. Se tomó como criterio de valoración principal el cambio de las MPc después del tratamiento con AAS. Se consideraron significativos los valores de p < 0,05.

Las características basales de los 43 pacientes diabéticos incluidos en el estudio (13 con DM1 y 30 con DM2; media de tiempo de evolución de la enfermedad, 17 años) se presentan en la tabla 2, y en la tabla 1 del material suplementario se recogen las características de los controles. La media de edad de la población diabética era 55 años; un 56% eran varones; un 21%, fumadores activos; un 93% presentaba dislipemia, y un 91% eran hipertensos. Un 53% de los pacientes estaban en tratamiento con inhibidores de la enzima de conversión de la angiotensina; un 65%, con antagonistas del receptor de la angiotensina II; un 7%, con bloqueadores beta; un 19%, con doxazosina; un 37%, con diuréticos; un 77%, con estatinas, y un 33%, con ezetimiba.

Los pacientes con DM1 tenían una media de 25 ± 10 años de evolución de la enfermedad, mientras que con DM2, 13 ± 9 años (análisis de la varianza de una vía, p = 0,001). En la situación basal, los pacientes con DM1 tenían aproximadamente el doble de MPc FT+ de origen plaquetario y monocitario y MPc CD62E+/– de origen endotelial que los participantes con DM2 (figura 2), lo cual posiblemente refleje la exposición a estrés metabólico durante toda la vida. De hecho, los valores basales de estas MPc mostraron correlación positiva con el tiempo de evolución de la enfermedad (Spearman, ρ = 0,371, ρ = 0,402, ρ = 0,330 y ρ = 0,335; p = 0,014, p = 0,008, p = 0,029 y p = 0,025, para las MPc FT+ derivadas de plaquetas y monocitos y las MPc CD62E+/– de origen endotelial respectivamente).

Figura 2.

Diferencias en las micropartículas circulantes anexina V+ basales según el tipo de diabetes mellitus. Gráficos de caja y bigotes que muestran el número de micropartículas circulantes positivas para el factor tisular (CD142+) de origen plaquetario (CD61+) (A) y de origen monocitario (CD14+) (B) y micropartículas circulantes de origen endotelial (CD146+) (C) y micropartículas circulantes de células endoteliales activadas (CD146+/CD62E+) (D) antes de la intervención con ácido acetilsalicílico según el tipo de diabetes mellitus. AAS: ácido acetilsalicílico; AV: anexina V; DM1: diabetes mellitus tipo 1; DM2: diabetes mellitus tipo 2; MPc: micropartículas circulantes; PFP: plasma libre de plaquetas. Las líneas del interior de los recuadros corresponden a los valores de mediana, los recuadros superior e inferior indican los percentiles 25 y 75, respectivamente, y las barras superiores e inferiores de fuera de los recuadros corresponden a los percentiles 10 y 90 respectivamente. Valor de p obtenido mediante un análisis de la varianza del número de micropartículas circulantes dependiendo del tipo de diabetes mellitus.

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En comparación con los controles, antes del tratamiento con AAS, los pacientes presentaban mayores concentraciones de todas las MPc cuantificadas, excepto las MPc de origen eritrocitario (CD235ab+), CD11b+/AV+ y el conjunto de las cargadas con FT (CD142+), que mostraron valores similares a las de los controles (tabla 2 del material suplementario).

Como medida de la eficacia del AAS, se determinó la concentración de tromboxano B2 en suero (obtenido en la misma extracción de sangre que para los tubos con citrato) antes y después de la intervención con 100 mg de AAS durante 10 días. Después del tratamiento con AAS, la inhibición de la ciclooxigenasa 1 fue > 99%, ya que la concentración basal de tromboxano B2 era de alrededor de 18,8 ± 2,8 ng/ml y, después de la intervención, 0,26 ± 0,19 ng/ml, lo cual indica ausencia de seudorresistencia al AAS y que el cumplimiento de la intervención fue excelente.

Los efectos generales del AAS fueron similares en ambos tipos de DM (tabla 3). En consecuencia, los cambios observados en la liberación de micropartículas tras la intervención con AAS se expresaron teniendo en cuenta conjuntamente ambos tipos de DM.

Tal como se muestra en la figura 3, al cabo de 10 días de administración de AAS, las MPc de origen eritrocitario (CD235a+/AV+) disminuyeron en un ∼17%. Las MPc derivadas de monocitos disminuyeron en un ∼22% (CD14+/AV+) y las MPc procedentes de monocitos activos se redujeron también (un ∼22 las MPc CD11b+/CD14+/AV+ y un 29% las MPc CD142+/CD14+/AV+). Además, las MPc derivadas de células de músculo liso se redujeron en un ∼52% (actina de músculo liso-α+/AV+) y las MPc derivadas de células de músculo liso que expresaban el FT (CD142+/actina de músculo liso-α+/AV+) disminuyeron también en un ∼54%.

Figura 3.

Diferencias expresadas en porcentaje de disminución de las micropartículas circulantes anexina V+ antes y después de la intervención con ácido acetilsalicílico. A: CD61+. B: CD235a+. C: CD14+. D: CD14+/CD11b+. E: CD14+/CD142+. F: actina alfa de músculo liso+. G: actina alfa de músculo liso+/CD142+. Se utilizó el CD61 como biomarcador de las plaquetas, el CD235a para los eritrocitos, el CD14 para los monocitos y la actina alfa de músculo liso para las micropartículas originadas en células de músculo liso. Se utilizaron el CD142 (factor tisular) y el CD11b (integrina αM) como biomarcadores de activación celular. AV: anexina V; CML: célula de músculo liso; MPc: micropartículas circulantes; FT: factor tisular. *p < 0,05 para la comparación antes-después de la intervención (prueba de la t de Student para muestras apareadas).

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Por otra parte, las concentraciones de MPc CD11b+/CD14+/AV+, actina de músculo liso-α+/AV+ y CD142+/actina de músculo liso-α+/AV+ alcanzaron después de la intervención con AAS valores similares a las de los controles no diabéticos con riesgo CV elevado.

Las concentraciones plasmáticas del total de MPc (AV+) y de MPc derivadas de plaquetas (CD61+/AV+), células endoteliales (CD146+/AV+), linfocitos (CD3+/AV+) y granulocitos (CD45+/CD3–/CD14–/AV+) no se modificaron con el tratamiento con AAS. La intervención con AAS no influyó en las concentraciones de MPc originadas en las plaquetas activadas, las células endoteliales, los linfocitos y los granulocitos.

El estudio no está exento de limitaciones. Los pacientes diabéticos suelen estar polimedicados (tabla 1). La medicación concomitante puede influir en la liberación de micropartículas, pero esta cuestión se resuelve en parte con el diseño del estudio, ya que se cuantificaron las MPc antes y después de la intervención de 10 días en cada paciente, por lo que la medicación concomitante no se modificó. No fue posible obtener datos sobre los efectos del AAS en los controles (pacientes con un riesgo CV alto pero sin DM ni ECV), ya que la intervención de 10 días de AAS no estaba justificada según el criterio del comité de ética del centro. Las guías actuales no especifican un umbral de riesgo CV a partir del cual deba usarse sistemáticamente AAS en los pacientes diabéticos para la prevención de la ECV. Aunque la población estudiada era de pacientes diabéticos de la práctica clínica real, tratados según lo indicado en las guías, sin signos de enfermedad aterosclerótica y que acudían a una clínica del metabolismo, es posible que no sea representativa de la población diabética total con riesgo de ECV elevado.