Se seleccionó a los individuos consecutivos de una cohorte prospectiva de pacientes con ICr ingresados en la Unidad de Ictus del Hospital del Mar (Barcelona, España) entre octubre de 2013 y septiembre de 2016 que cumplieran los siguientes criterios6: a) ictus isquémico o accidente isquémico transitorio; b) edad entre 50 y 89 años; c) causa indeterminada según los criterios SSS-TOAST2. Se excluyó a los pacientes con antecedentes de ictus hemorrágico, FA o aleteo auricular previos, contraindicación permanente para la anticoagulación oral, cirugía mayor o eventos cardiacos recientes (< 1 mes), enfermedad cardiovascular grave o comorbilidades, esperanza de vida corta (< 1 año) o ictus grave (escala de Rankin modificada >4)6. El estudio siguió los principios nacionales e internacionales (Declaración de Helsinki) y fue aprobado por el comité de ética local (2013/5055/I). Todos los pacientes o familiares más próximos tuvieron que firmar el formulario de consentimiento informado específico.

Se extrajo sangre de una vía periférica en el momento del ingreso. Se trató de inmediato a los pacientes con antiagregantes plaquetarios y se los trasladó a la unidad de ictus con monitorización electrocardiográfica continua. Se les realizó un ecocardiograma transtorácico bidimensional en las primeras 48 h con un equipo General Electric Vivid E9 (GE Healthcare, Estados Unidos) para evaluar las dimensiones y la funcionalidad del ventrículo izquierdo y la aurícula izquierda. Véase más detalles en el material adicional.

De acuerdo con el protocolo, a todos los pacientes sin causa del ictus establecida se les implantó un monitor cardiaco insertable cuando se los trasladó a planta. Los monitores cardiacos insertables (Biomonitor y Biomonitor-2, Biotronik, Alemania) se programaron con el algoritmo específico para la detección de FA, definido por una variabilidad del intervalo RR> 12,5% con una duración> 1min, como se ha descrito anteriormente6. Los registros detectados automáticamente como posibles episodios de FA fueron revisados por un cardiólogo especializado. La carga de FA se evaluó por el porcentaje de tiempo de seguimiento que un individuo estuvo en FA y, en segundo lugar, por el número de episodios de FA, como se propuso anteriormente16. Un tiempo de FA <0,05% definió a los participantes con una carga de FA baja, mientras que con tiempo de FA ≥ 0,05% la carga de FA fue alta17. Si en algún momento se confirmaba la FA, se iniciaba anticoagulación oral.

Este es un estudio de casos y controles que incluyó a los pacientes prospectivamente y los asignó a casos (pacientes con FA, ICr-FA) o controles (pacientes en RS continuo, ICr-RS) después de 6 meses de seguimiento, el punto temporal final del análisis primario. Se realizó un análisis secundario a los 12 meses de seguimiento.

Como es habitual en los estudios de expresión génica18, el diseño del estudio siguió un enfoque de 2 pasos, es decir, una fase de descubrimiento utilizando datos de micromatrices de alto rendimiento, con selección de biomarcadores candidatos potenciales, seguida de una fase de reproducción (y confirmación) de microARN candidatos en una cohorte independiente (figura 1). En la fase de descubrimiento, se seleccionó a 18 pacientes emparejados por edad y sexo (conjunto I): 9 ICr-FA y 9 ICr-RS. Se realizó un seguimiento de los 9 pacientes de cada grupo durante 12 meses para garantizar que permanecieran clasificados por igual a los 6 o 12 meses (es decir, no ocurrieron episodios de FA en el ICr-RS más allá de los 6 meses), lo que corroboraba su idoneidad para el estudio a 6 y 12 meses. Paralelamente, en esta fase se realizó el cribado de un grupo adicional de 9 pacientes (sin antecedentes de FA) que presentaban FA en el momento del ingreso (ictus cardioembólico [ICE], ICE-FA), también emparejados con los grupos anteriores, con el objetivo de orientar aún más la selección de microARN. En la fase de reproducción, se utilizó una cohorte independiente de 46 pacientes no emparejados (grupo II), 19 de los cuales presentaron FA a los 6 meses. Se analizó a la misma cohorte a los 12 meses de seguimiento, cuando 23 habían presentado FA (figura 1).

Figura 1.

Diseño del estudio y población. AIT: accidente isquémico transitorio; FA: fibrilación auricular; ICE: ictus cardioembólico; ICr: ictus criptogénico; MCI: monitores cardiacos insertables; OA: Open Array; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; RS: ritmo sinusal.

(0,71MB).

Los microARN se aislaron del plasma utilizando el equipo miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen Hilden, Alemania). En la fase de descubrimiento se utilizó el perfil de microARN humano avanzado TaqMan OpenArray (ThermoFisher, Estados Unidos), que analizó 754 microARN humanos, y los niveles de expresión de todos los microARN se analizaron con el software Cloud (ThermoFisher). Los microARN con una expresión diferencial importante entre grupos (p <0,05 y factor multiplicador> 2 o <0,5) se seleccionaron para la reproducción, que se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Los resultados se analizaron con el software Expression Suite (Life Technologies). Véase más detalles en el material adicional.

Los datos clínicos se comunican como media±desviación estándar o frecuencia (%). Los resultados de la expresión de microARN se exponen en factor multiplicador frente a los controles, donde 1 es igual a la media de expresión de todos los controles y, por tanto, representa el valor de referencia19. El análisis OpenArray de la expresión diferencial se evaluó con el software Cloud específico (Life Technologies) utilizando el método de normalización global. Para otras comparaciones se aplicaron la prueba de la t de Student, el análisis de la varianza de una vía (ANOVA) o la prueba de la χ2, en su caso. Dado el diseño del estudio de casos y controles, la asociación entre las variables y la FA se evaluó mediante modelos de regresión logística binaria. Puesto que no existen valores de referencia establecidos de microARN, la expresión de los microARN de interés se estratificó en cuartiles o por encima/por debajo de la mediana de todos los valores obtenidos en nuestra cohorte. Las variables que mostraron asociación con p <0,1 en el modelo univariante se incluyeron en el análisis multivariante. La capacidad discriminatoria del modelo se evaluó por el área bajo la curva de características operativas del receptor. Las probabilidades pronosticadas se calcularon a los 6 meses mediante modelos lineales generalizados utilizando las variables de interés del modelo multivariante, y se graficaron de acuerdo con ellas. La significación se fijó en p <0,05. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS versión 26.0 para Windows (SPSS Inc., Estados Unidos).

Durante el periodo de estudio, 530 pacientes de 50 a 89 años ingresaron con ictus isquémico. Después de un estudio diagnóstico completo, se consideró aptos para el estudio a 74 pacientes con ICr, de los que después se excluyó a 10. Por lo tanto, la población del estudio estuvo compuesta por 64 pacientes con diagnóstico definitivo de ICr en seguimiento continuo con un monitor cardiaco insertable implantado antes del alta.

Las características clínicas de la población final del estudio se resumen en la tabla 1. La media de edad fue 75±11 años, y 29 pacientes (45%) eran mujeres. La prevalencia de factores de riesgo cardiovascular fue alta; 11 pacientes (17%) ya habían tenido un ictus o accidente isquémico transitorio. La evaluación cardiaca durante el ingreso mostró dimensiones y función normales del ventrículo izquierdo y la aurícula izquierda en la población total. Las características, el tratamiento y la gravedad del ictus se presentan en la tabla 1.

De los 64 pacientes, 28 presentaron FA (25 paroxística y 3 crónica) en los primeros 6 meses y constituyeron el grupo de ICr-FA. Todos los pacientes iniciaron anticoagulación oral. Los pacientes con FA presentaron una mediana de 4,3 [0,6-2] episodios de FA al mes, con una mediana de tiempo total de FA de 183,9 [23,7-775,6] min, lo que representa el 0,071% [0,009-0,30] del tiempo de seguimiento. Los 36 pacientes restantes mostraron RS continuo (grupo de ICr-RS). Las características de los pacientes con FA y en RS se resumen en la tabla 1. Los pacientes del grupo de ICr-FA tendían a presentar mayores dimensiones ventriculares y auriculares junto con menor fracción de eyección de la aurícula izquierda que los pacientes del grupo ICr-RS.

Las características de los pacientes incluidos en la fase de descubrimiento (9 pacientes en ICr-FA, 9 en ICr-RS y 9 en ICE-FA) se resumen en la tabla 1 del material adicional. Todos los grupos se emparejaron por sexo y edad, con 4 mujeres y una media de edad de 75 años. Dieciséis microARN se expresaron de manera diferenciada en ICr-FA frente a ICr-RS (consulte la lista completa en la tabla 2 del material adicional), de los cuales 8 surgieron como candidatos potenciales en función de su estabilidad plasmática. Estos se representan en la figura 2A (área sombreada). Los 8 candidatos mostraron una expresión relativamente constante entre ICr-FA y ICE-FA en comparación con los controles y 5 de ellos (miR-744-5p, miR-1-3p, miR-377-3p, miR-425-5p y miR-19b-3p) también fueron considerablemente diferentes entre los pacientes con ICE-FA e ICr-RS, de modo que estos podrían ser indicadores potenciales de la presencia de un entorno favorable a la FA, independientemente de si la arritmia se hubiera confirmado o continuaba siendo subclínica. Los valores de expresión de los 8 microARN candidatos en el ensayo Open Array se muestran en la figura 2B.

Figura 2.

A: resultados del estudio Open Array. De los 854 microARN evaluados en los 3 grupos de estudio (ICr-RS, ICr-FA e ICE-FA), 8 se expresaron de manera diferencial entre ICr-FA e ICr-RS (área sombreada en gris), de los cuales 5 también se expresaron de manera diferente entre ICE-FA e ICr-RS (en negrita); los microARN sobrexpresados se presentan en azul, mientras que los microARN regulados a la baja aparecen en naranja. B: resultados de los 8 microARN seleccionados para la reproducción; los datos se expresan en Rq (FM) frente al grupo ICr-RS (control), que se normalizó a 1; los valores de p específicos se presentan en la tabla 2 del material adicional. C: resultados de la expresión de microARN plasmático en la cohorte de reproducción; microARN-1-3p fue el único candidato del que se confirmó que estaba considerablemente aumentado en pacientes con ICr-FA frente a ICr-RS. FA: fibrilación auricular; FM: factor multiplicador; ICE: ictus cardioembólico; ICr: ictus criptogénico; RS: ritmo sinusal. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(0,55MB).

Los 8 microARN candidatos se reprodujeron en una cohorte independiente definida por la presencia o ausencia de FA a los 6 meses (conjunto 2, tabla 1 del material adicional). Los resultados se muestran en la figura 2C. Solo las concentraciones plasmáticas de miR-1-3p permanecieron considerablemente aumentadas en los pacientes con ICr-FA frente a ICr-RS (aumento de 2,81 veces, p=0,014).

En la cohorte total (n=64), se investigó más a fondo la asociación potencial entre miR-1-3p y FA. Puesto que no se ha establecido el «intervalo normal» de las concentraciones plasmáticas de miR-1-3p y los valores del factor multiplicador no proporcionan concentraciones plasmáticas reales, sino un valor que es proporcional a su concentración, los resultados de miR-1-3p se estratificaron en cuartiles (Q1-Q4). Como se muestra en la figura 3A, los valores de miR-1-3p mostraron una asociación positiva con el riesgo de FA, donde los pacientes en Q4 y Q3 tenían más probabilidades de presentar FA a los 6 meses de seguimiento (el 69 y el 56% respectivamente) en comparación con los de los cuartiles inferiores (el 31% en Q2 y el 19% en Q1, p=0,017).

Figura 3.

A: aparición de FA según cuartiles de miR-1-3p en la población total. B: asociación entre valores de miR-1-3p y carga de FA. El porcentaje de tiempo en FA (superior derecha) y el número de episodios de FA por mes (superior izquierda) se presentan según los cuartiles de miR-1-3p. En el panel inferior, se representa la distribución de los cuartiles de miR-1-3p entre pacientes sin FA, carga de FA baja y carga de FA alta. FA: fibrilación auricular.

(0,48MB).

Además, las concentraciones de miR-1-3p aparecieron moderadamente asociadas con la carga de FA en nuestra cohorte. La figura 3B muestra el porcentaje de tiempo en FA (superior derecha) y la cantidad de episodios de FA por mes (superior izquierda) que se registraron entre los pacientes en los 4 cuartiles de miR-1-3p durante los 6 meses de seguimiento. La carga de FA medida por ambos parámetros parecía mayor entre los pacientes en los cuartiles más altos de miR-1-3p. El grupo inferior de la figura 3B representa la distribución de los cuartiles de miR-1-3p entre pacientes sin FA, carga baja de FA y carga alta de FA. Concretamente, más de la mitad de los pacientes con carga alta de FA tenían valores de miR-1-3p en Q4, mientras que ninguno tenía valores de miR-1-3p en Q1.

A continuación se evaluó si miR-1-3p, junto con datos clínicos, podría proporcionar una orientación temprana en la identificación de pacientes con ICr y FA subclínica. Para una mejor aplicabilidad, se agruparon todos los valores de miR-1-3p por encima (Q3 + Q4) o por debajo (Q1 + Q2) de la mediana.

La tabla 2 resume los resultados de los análisis de regresión logística. Solo 2 parámetros permanecieron asociados de manera independiente con la FA en el análisis multivariante: a) la fracción de eyección de la aurícula izquierda, asociada con una reducción relativa del 11% del riesgo de FA por unidad de aumento, y b) concentración plasmática de miR-1-3p elevada, donde valores por encima de la mediana se asociaron con un aumento de 8,5 veces del riesgo de FA a los 6 meses. El modelo que incluye ambas variables mostró una capacidad discriminatoria, evaluada por el área bajo la curva de características operativas del receptor, de 0,860 (0,760-0,960; p <0,001). La figura 4 muestra las probabilidades previstas estimadas de FA documentada a los 6 meses del ictus según estas variables.

Figura 4.

Probabilidades previstas de riesgo de FA a los 6 meses en la cohorte total según los valores de FEAI y miR-1-3p, expresadas por encima (rojo) o por debajo (azul) de la mediana de todos los valores. Las áreas sombreadas representan intervalos de confianza del 95%. FA: fibrilación auricular; FEAI: fracción de eyección de la aurícula izquierda. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(0,1MB).

Para analizar más a fondo el impacto clínico potencial del miR-1-3p plasmático en la evaluación de la FA subclínica en pacientes con ICr, se investigó la asociación entre el miR-1-3p y la presencia de FA a los 12 meses. Otros 4 pacientes presentaron FA entre los 6 y los 12 meses de seguimiento (figura 1). Los valores de miR-1-3p fueron significativamente más altos en los pacientes que presentaron FA a los 12 meses que en aquellos con RS continuo (figura 5A). Además, los cuartiles de miR-1-3p se asociaron positivamente con la presencia de FA (figura 5B). Por último, mediante análisis de regresión logística, tanto el miR-1-3p por encima de la mediana como la fracción de eyección de la aurícula izquierda permanecieron asociados de manera independiente con la presencia de FA a los 12 meses (tabla 3).

Figura 5.

Asociación entre las concentraciones de miR-1-3p y la FA a los 12 meses. A: resultados de expresión de microARN plasmático en la cohorte de reproducción, con 23 pacientes en RS y 23 con al menos 1 episodio de FA. B: aparición de FA a los 12 meses según cuartiles de miR-1-3p en la población total. FA: fibrilación auricular; FM: factor multiplicador; ICr: ictus criptogénico; RS: ritmo sinusal.

(0,13MB).

Nuestro estudio tiene varias limitaciones. El tamaño de la muestra es pequeño, en especial en la cohorte de reproducción, pero incluye a una población muy valiosa de pacientes consecutivos evaluados minuciosamente mediante seguimiento continuo. Aun así, la población final no es considerablemente menor que la utilizada en estudios previos sobre microARN circulantes que utilizaron la metodología de alto rendimiento18. En nuestra población hay varones y mujeres con edades entre 50 y 89 años. Por lo tanto, estos resultados no deben extrapolarse a otros grupos de edad. Este estudio se realizó en un solo hospital terciario y carece de validación externa en otras cohortes, lo que sería muy deseable para establecer definitivamente el papel de miR-1-3p como biomarcador de FA subclínica en pacientes con ICr. Por último, no se pudo confirmar que las concentraciones elevadas de miR-1-3p circulante reflejen una alta expresión auricular de miR-1-3p o la presencia de un sustrato que favorece la FA. Sin embargo, nuestros resultados apuntan a miR-1-3p como biomarcador potencial de la FA subclínica independientemente de su expresión tisular o del sustrato auricular. Deberá evaluarse en estudios futuros si altas concentraciones plasmáticas de miR-1-3p pueden ser causa directa de la promoción de la FA en el contexto del ICr, lograr una verdadera aplicabilidad clínica e incluso ofrecer orientación para el inicio precoz de la anticoagulación oral.