Se incluyó a todos los probandos que habían sido remitidos para una evaluación genética cardiovascular en el mismo laboratorio de referencia a causa de una MCH o una MCR, presentaban una variante de FLNC-mRod2 y estaban disponibles para el estudio. Se excluyó a todos los individuos con otra variante causal que explicara el fenotipo. Después de la primera evaluación, se seleccionó a las familias con miocardio en dientes de sierra en la exploración de imagen cardiovascular en un estudio clínico detallado.

Se llevó a cabo una evaluación clínica exhaustiva, que incluyó una evaluación detallada de la historia clínica del paciente, el árbol genealógico, la creatincinasa, un electrocardiograma de 12 derivaciones, una monitorización Holter y una evaluación ecocardiográfica por un experto. La disfunción de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) se evaluó con el método de Simpson biplano11. La función diastólica se evaluó según las recomendaciones actuales12. Se analizó el aspecto del miocardio del ventrículo izquierdo (VI) prestando especial atención a la hipertrabeculación, según los criterios diagnósticos actuales para la MCNC con 2 capas bien definidas (capa delgada compactada y capa gruesa no compactada)13. El miocardio en dientes de sierra se identificó por la presencia de múltiples proyecciones e invaginaciones profundas en un miocardio denso y compactado.

El estudio fue aprobado por el comité de ética de investigación local. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para la inclusión en el estudio de todos los participantes o, en el caso de pacientes menores de edad o personas fallecidas, de los familiares de primer grado.

En el mismo centro se obtuvieron muestras de sangre de los probandos para la secuenciación genética mediante un panel de secuenciación de nueva generación orientado por el fenotipo. En el caso de los probandos con solapamiento o un fenotipo no definido, se empleó un panel de secuenciación de nueva generación que incluía genes relacionados con la cardiopatía o genes candidatos. Se capturaron los exones codificadores y los límites intrónicos de 247 genes relacionados con enfermedades cardiovasculares hereditarias (tabla 1 del material adicional) utilizando una biblioteca de sondas específica.

Para la evaluación de la patogenicidad de las variantes genéticas, se consideraron datos como la frecuencia en las bases de datos públicas (por ejemplo, Human Gene Mutation Database, Single Nucleotide Polymorphism Database, NHLBI GO Exome Sequencing Project y ClinVar o Genome Aggregation Database14–16), su descripción previa en la literatura y la conservación entre las especies. Después de la identificación de las variantes raras del gen FLNC en los pacientes índice, se llevó a cabo sistemáticamente un examen de detección genética en cascada en todos los familiares disponibles mediante secuenciación de ADN Sanger. Para las variantes de novo, se confirmó la paternidad cuando fue posible. Por último, se determinó el logaritmo de la puntuación de probabilidad17 y se determinó la clasificación del American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)18. Puede consultarse información detallada sobre el método para el análisis genético en el material adicional.

Se llevó a cabo una caracterización histológica, histoquímica e inmunohistoquímica completa del tejido cardiaco procedente de 3 corazones explantados (paciente de la familia F y familia C, pacientes 2 y 3). Las muestras de tejido se fijaron durante al menos 48 h en formaldehído tamponado neutro al 10%, se lavaron, se deshidrataron con concentraciones crecientes de etanol, se aclararon en xilol y finalmente se incluyeron en parafina según un protocolo convencional19.

Se obtuvieron cortes histológicos de un grosor de 5 μm, que se desparafinaron, se hidrataron y se examinaron en los siguientes pasos: a) se realizó un examen histológico general con hematoxilina-eosina; b) se tiñeron histoquímicamente las miofibrillas de los miocardiocitos con hematoxilina de Heidenhain; c) se evaluó la organización y distribución de los componentes principales de la matriz extracelular (MEC) con la tinción de picrosirio del colágeno, la técnica de reducción de metal de Gomori para las fibras reticulares, la tinción histoquímica de orceína para las fibras elásticas y la tinción de azul alcián para los proteoglicanos. Además, se identificaron los colágenos de tipo I y IV (COL-I y COL-IV respectivamente) mediante inmunohistoquímica, y d) se determinó el patrón de distribución del FLNC y la conexina-43 (Cx-43) mediante inmunohistoquímica. La información técnica sobre los anticuerpos utilizados se resume en la tabla 2 del material adicional.

Además de la caracterización histológica, se llevó a cabo un análisis semicuantitativo del cociente célula/colágeno del área de MEC en 3 cortes diferentes procedentes de 3 preparaciones tisulares distintas, con el método de picrosirio del programa informático Image J (National Institute of Health, Estados Unidos) y siguiendo un procedimiento descrito anteriormente20. Además, se seleccionaron 20 puntos en 3 cortes de cada condición teñidos con el método de hematoxilina de Heidenhain y se determinó la intensidad de la reacción histoquímica para las miofibrillas. Por último, se calculó la anchura celular en 20 células por imagen, seleccionadas en 3 imágenes de cada trastorno.

Para detectar las alteraciones histológicas específicas atribuibles a las variantes de FLNC-mRod2, se compararon las observaciones histológicas con una muestra de tejido cardiaco no patológico (control) y con una muestra de un portador de una FLNC-tv procedente de nuestra cohorte histórica. El caso de FLNC-tv mostró el fenotipo solapado reconocido de miocardiopatía dilatada y miocardiopatía arritmógena9,10.

Se utilizó el plásmido de tipo natural o salvaje (wild-type) pCMV6-FLNC (212462; OriGene Technologies, Estados Unidos) como plantilla para insertar las variantes p.P2301L, p.E3224K y p.R2340W, utilizando el kit Quik Change Lightning (Agilent Technologies, Estados Unidos) en combinación con los oligonucleótidos apropiados (tabla 3 del material adicional). Se verificó el FLNC que codificaba el ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) de todos los plásmidos con el método de secuenciación Sanger (Macrogen, Países Bajos). Se cultivaron células HT1080 (DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Culture, ACC315, Alemania) y H9C2 (ATCC, CRL-1446, Estados Unidos) en cámaras μSlide (ibidi GmbH, Alemania) utilizando el medio de cultivo Modified Eagle Medium de Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10% y penicilina/estreptomicina. Se utilizó Lipofectamin 3000 (Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos) para la transfección celular según las instrucciones del fabricante. A las 24 h de la transfección, se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato y se fijaron durante 10min a temperatura ambiente utilizando Histofix al 4% (Carl-Roth, Alemania). El análisis inmunocitoquímico se llevó a cabo, según lo recientemente descrito, mediante el microscopio confocal TCS SP8 (Leica Microsystems, Alemania)4.

Para los análisis estadísticos se empleó el programa SPSS Statistics, versión 21.0 (IBM Corp, Estados Unidos). Las variables continuas se presentan en forma de media ± desviación estándar para cada parámetro. Para la cuantificación de las variables histológicas, se aplicó la prueba de la U de Mann-Whitney (no paramétrica). Todas las variables cualitativas se expresan mediante frecuencia y porcentaje.

Se incluyó a 21 familias no relacionadas, procedentes de 7 centros de referencia, a las que se examinó genéticamente respecto a la MCH/MCR y en las que se encontró que eran portadoras de variantes raras de FLNC-mRod2 (figura 1 del material adicional). Un total de 11 familias (52%) con 20 individuos (37 [23,7-52,7] años) mostraron 15 casos con un fenotipo cardiaco consistente en una MCH o una MCR, con una hipertrabeculación del ventrículo izquierdo (HTVI) marcada y atípica que distorsionaba el VI, con presencia de numerosos puentes cruzados de proyecciones musculares. Estas protrusiones de puentes musculares en el VI delineaban criptas profundas en un único miocardio denso y compactado (figura 1), que se ha identificado como aspecto en «dientes de sierra», diferente de las 2 capas características de la MCNC (capa fina compactada y capa gruesa no compactada). Además, esta HTVI singular se confirmó en 3 corazones explantados (figura 2).

Figura 1.

Imágenes de resonancia magnética cardiaca (recuadros superior y central) y de ecocardiografía (recuadro inferior) que muestran el aspecto de la hipertrabeculación del ventrículo izquierdo en dientes de sierra con proyecciones musculares y criptas profundas que distorsionan la arquitectura normal del ventrículo izquierdo. A: paciente III.1 de la familia C. B: paciente II.2 de la familia A. C: paciente de la familia E.

(0,24MB).

Figura 2.

Imágenes de ecocardiografía (A) e imágenes macroscópicas del corazón explantado (B) del paciente índice de la familia C, de 24 y 36 años respectivamente. Las imágenes de ecocardiografía mostraron protrusiones musculares en el ventrículo izquierdo. Las imágenes anatomopatológicas mostraron la hipertrabeculación atípica intensa, con recesos profundos.

(0,24MB).

En la cohorte total de 20 individuos, la mediana de edad en el momento del diagnóstico era 37 [23,7-52,7] años y 12 (60%) eran varones. La MCH fue más frecuente (13; 65%) que la MCR (4; 20%), y 15 individuos (75%) mostraron un aspecto en dientes de sierra. Un total de 16 individuos (80%) presentan una disfunción diastólica marcada (grado II o III) y en 10 (50%) había una fibrilación auricular, a veces en la adolescencia o al inicio de la edad adulta.

Los pacientes con MCH presentaban un aumento del tabique interventricular (14,3±7mm), una aurícula izquierda dilatada (45,6±10,4mm) y una FEVI inicialmente conservada (58,5±10,3%). Se halló una válvula aórtica bicúspide en 2 individuos de la familia A y 2 de la familia C. Además, se realizó una resonancia magnética cardiaca con evaluación del realce tardío de gadolinio a 9 pacientes, pero ninguno mostró una cicatriz con realce tardío de gadolinio. Todos ellos mostraron un electrocardiograma anormal: en 5 había una inversión de la onda T en derivaciones precordiales y en 8, en derivaciones inferiores y precordiales; 5 tenían un bloqueo de rama derecha del haz de His y en 2 se observó un retraso de la conducción intraventricular inespecífico. Ninguno de los pacientes tenía voltajes bajos ni bloqueo auriculoventricular. La monitorización Holter no identificó un aumento de las extrasístoles ventriculares, pero en 1 individuo identificó una taquicardia ventricular no sostenida. Ninguno de los individuos tenía síntomas, signos o antecedentes de miopatía del músculo esquelético (concentración media de creatincinasa, 137 ± 58 U/l). El cribado genético en cascada para la detección sistemática mostró una cosegregación leve de 6 variantes con el fenotipo (familias A, C, D, H, J, K) (figura 3), mientras que los 5 casos restantes fueron de novo (tabla 1; figura 2 del material adicional y tabla 4 del material adicional). Los no portadores no mostraban manifestaciones de miocardiopatía.

Figura 3.

Árboles genealógicos con una cosegregación leve. Los cuadrados indican sexo masculino y los círculos, sexo femenino; las barras inclinadas indican individuos fallecidos, el sombreado negro indica un fenotipo de miocardiopatía, la banda negra indica un portador asintomático, N indica ausencia del fenotipo y (?) indica no disponible para la evaluación. Las flechas + P indican el probando. Portadores heterocigotos (E1 −/+) y no portadores (E1 −/−). DAI: desfibrilador automático implantable; IC: insuficiencia cardiaca; TxC: trasplante cardiaco; TVS: taquicardia ventricular sostenida.

(0,36MB).

En las 10 familias restantes en las que se identificaron variantes de FLNC-mRod2 sin aspecto en dientes de sierra, había 4 pacientes con MCH obstructiva (1 con HTVI pero sin el rasgo en dientes de sierra), 1 con MCH en el análisis post mortem, 1 con MCH apical, 1 con MCR y 3 individuos sin miocardiopatía.

Después de una mediana de seguimiento de 6,49 [3,8-21,33] años tras el diagnóstico del fenotipo, 11 pacientes (55%) habían sufrido insuficiencia cardiaca (IC) sintomática de clase ≥ II de la New York Heart Association (NYHA), y 3 de ellos necesitaron un trasplante cardiaco debido a la IC avanzada a una edad de entre 30 y 40 años. Tres pacientes (15%) fallecieron por IC. Además, 4 (26,6%) sufrieron un síncope durante el seguimiento y 2, una taquicardia ventricular sostenida (TVS) que motivó el implante de un desfibrilador automático implantable (DAI).

En la figura 4 se muestra la ubicación de las 9 variantes raras identificadas en el dominio de ROD2 de FLNC. Todas las variantes missense observadas en esta cohorte se encontraban en el dominio ROD2, y específicamente en los dominios de tipo Ig 18 a 21. Ninguna de las variantes identificadas estaba presente en las bases de datos de poblaciones de control y los predictores bioinformáticos indicaron que eran probablemente nocivas. La clasificación del ACMG identificó 4 variantes como probablemente patógenas y 5 variantes como de significado desconocido (tablas 5 y 6 del material adicional). No se identificó una segunda variante genética causal relevante en ninguno de los probandos, y se confirmó la paternidad en 4 de los casos de novo. No se detectó ninguna variación en el número de copias (CNV) en la cohorte seleccionada. En todos estos casos, la calidad de la muestra fue suficiente para llevar a cabo este análisis.

Figura 4.

Representación de la proteína FLNC con la localización de las variantes de FLNC incluidas.

(0,33MB).

La tinción de hematoxilina-eosina reveló la presencia de células cardiacas moderadamente más grandes en las muestras de corazones con FLNC-tv en comparación con las de corazones con FLNC-mRod2 y las de los controles (figura 5A). También puso de manifiesto una menor densidad de miofibrillas y una ligera reducción del espacio intercelular en los tejidos afectados por FLNC-mRod2, lo cual daba lugar a un patrón de organización del tejido más compacto en estas muestras específicas (figura 5B). Estos resultados se confirmaron mediante análisis histológicos cuantitativos (figura 3 del material adicional). El análisis inmunohistoquímico de la FLNC confirmó la ubicación intracelular de esta proteína en todas las muestras, pero en las muestras afectadas por FLNC-tv, esta proteína mostraba una distribución irregular y una ausencia completa en el disco intercalar (DI) (figura 5C). En cambio, en los tejidos afectados por FLNC-mRod2, estaba presente en el aparato contráctil, como en el grupo de control, pero especialmente positiva a nivel de los DI.

Figura 5.

Patrón histológico, histoquímica miofibrilar, inmunohistoquímica de FLNC y análisis de remodelado de MEC en tejidos cardiacos con afección genética por FLNC. A: tinción de hematoxilina-eosina de muestras de control y de tejido cardiaco con afección genética (FLNC-tv y FLNC-mRod2), que muestra el aumento del espacio intercelular en FLNC-tv y la compactación en FLNC-mRod2. B: hematoxilina de Heideinhain para las miofibrillas, que muestra la menor densidad en el caso de FLNC-mRod2. C: distribución intracelular de FLNC según lo determinado mediante inmunohistoquímica. Obsérvese la ausencia de FLNC en el disco intercalar de la muestra con FLNC-tv. D: identificación histoquímica de los colágenos fibrilares mediante tinción de picrosirio (en rojo) con un aumento de estas fibras en las muestras con afección genética. E y F: identificación inmunohistoquímica del colágeno tipo I (E) y tipo IV (F). Barra de escala: 20 μm. CTR: control; FLNC-mRod2: variante missense en el dominio FLNC-Rod2; FLNC-tv: variante truncada del gen de la filamina C.

(1,33MB).

Por otro lado, el análisis de remodelado reveló la presencia de alteraciones fibrosas en las muestras con alteración genética en comparación con las de control (figura 5D), y mostró un claro aumento de las fibras de colágeno fibrilares. En las muestras afectadas por FLNC-mRod2, este aumento de las fibras de colágeno se observó alrededor de los miocardiocitos, que mostraban un patrón compactado y bien definido diferente del observado con la FLNC-tv (abundante y con una organización irregular) (figura 5E,F). Por último, el proceso fibrótico se confirmó de forma semicuantitativa, y se puso de manifiesto que el contenido de colágeno aumentado alcanzaba un 49,2±7,9% en las muestras afectadas genéticamente por FLNC-tv seguido de un 29±2,5% en las afectadas por FLNC-mRod2, en ambos casos considerablemente superiores al 26,5±2,2% de contenido de colágeno observado en el control (figura 3 del material adicional). Además, el remodelado de la red de colágeno (respuesta fibrosa) se acompañaba de una alteración de las fibras reticulares y del contenido de proteoglicanos ácidos, así como de su intensidad y su patrón (figura 4 del material adicional). Todas estas observaciones histológicas en las muestras afectadas por FLNC-mRod2 fueron uniformes en las 3 muestras.

Se realizó una transfección de células HT1080 y H9C2 con plásmidos de expresión para el FLNC de tipo salvaje y mutante (p.P2301L, p.E2334K y p.R2340W). Los análisis confocales revelaron una localización celular comparable para el FLNC de tipo salvaje y mutante en las células con transfección (figura 6; figura 5 del material adicional), lo cual indicaba que la agregación proteica patogénica era improbable con las variantes missense descritas.

Figura 6.

Se realizó una transfección de células H9C2 con plásmidos de expresión para la filamina C de tipo salvaje y mutante (p.P2301L, p.E2334K y p.R2340W). La filamina C marcada con c-Myc se muestra en rojo. La actina F (verde) se contuvo mediante faloidina conjugada con Alexa-488. Se muestran imágenes de células representativas. Barra de escala, 10μm.

(0,98MB).

Las principales limitaciones de este estudio son el pequeño número de pacientes evaluados y su diseño retrospectivo. De las 9 variantes raras, 5 se consideran variantes de significado desconocido, lo cual limita las conclusiones que pueden extraerse. Por lo que respecta a la histología, dada la naturaleza de las muestras, se incluyeron solo unas pocas muestras cardiacas independientes afectadas por este trastorno genético concreto, y ello limita la posibilidad de realizar análisis cuantitativos y estadísticos. La caracterización del tejido en la resonancia magnética cardiaca tiene la limitación del carácter retrospectivo del estudio. Además, es posible que las células HT1080 no reproduzcan la fisiología de los miocardiocitos humanos.