El tejido arterial coronario (n=10) se obtuvo de las arterias coronarias de pacientes con EC que se sometieron a cirugía de trasplante cardiaco. Las muestras de control (n=7) se obtuvieron de donantes fallecidos que habían sufrido un accidente de tráfico o un ictus y muerte cerebral certificada. Los donantes carecían de antecedentes de enfermedad cardiovascular, y las muestras no mostraban signos de patología. Los cirujanos obtuvieron todo el tejido coronario durante intervenciones de trasplante cardiaco realizadas en el Hospital Popular de la Región Autónoma Zhuang de Guangxi (China). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de las familias y el Comité Ético del Hospital Popular de la Región Autónoma Zhuang de Guangxi aprobó el protocolo del estudio.

Se lisaron las muestras coronarias y se obtuvo la proteína total. Tras cuantificar con el kit de análisis de proteínas con ácido bicinconínico (BCA), se añadieron 20 μg de proteína a la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico al 12% (SDS-PAGE). Se separaron las proteínas por medio de electroforesis y a continuación se transfirieron a las membranas de transferencia PVDF FL Immobilon. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% y se incubaron con anticuerpo anti-IL-5 (Santa Cruz Biotechnology) y con anticuerpo contra la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, tecnología para señalización celular) a 4°C durante toda la noche antes de la incubación con anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h. Las proteínas se visualizaron y cuantificaron utilizando un sistema de imagen infrarroja en 2 colores (Odyssey; LI-COR Biosciences). Los niveles de expresión de proteínas se normalizaron al control de GAPDH.

Tras el lisado de las células y el tejido coronario con el reactivo TRIzol, se obtuvo el ARN mensajero (ARNm) total. Después, se sintetizó el ADN complementario (ADNc) a partir de 2 μg del ARNm total con cebadores oligo (dT) y con un kit de transcriptasa inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las amplificaciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron utilizando una mezcla maestra LightCycler 480 SYBR Green (todo de Roche). Las secuencias del cebador aparecen en la tabla 1. Se determinaron los niveles de expresión relativa del ARNm y se normalizaron a la GAPDH en la muestra correspondiente.

Todas las muestras coronarias se fijaron con paraformaldehído neutro al 4%; a continuación se incluyeron en parafina, se cortaron en secciones de 5 μm y se montaron en portaobjetos. Se recurrió a la tinción por inmunofluorescencia para detectar la expresión de IL-5 en cada muestra. Para determinar la fuente de IL-5, se realizó una tinción doble por inmunofluorescencia con los anticuerpos anti-CD4, anti-CD68 y anti-IL-5.

Entre junio de 2016 y diciembre de 2017, se llevó a cabo en el mismo hospital una nueva selección de pacientes consecutivos con dolor torácico en quienes se sospechaba EC. Todos los pacientes se sometieron a angiografía coronaria. En función de los síntomas clínicos y los resultados del angiograma coronario y el electrocardiograma, se dividió a los pacientes en 4 grupos: a) grupo sin EC (n=36; criterios de inclusión: el dolor torácico no se acompañaba de cambios en el electrocardiograma ni de estenosis coronaria o espasmo coronario tras la inyección intracoronaria de acetilcolina administrada en la angiografía coronaria); b) grupo con angina estable (n=51; criterios de inclusión: malestar torácico característico inducido por esfuerzo asociado con desviación descendente o depresión horizontal del segmento ST> 1mm en una prueba de esfuerzo; c) grupo con angina inestable (n=44; criterios de inclusión: dolor torácico en reposo con cambios electrocardiográficos de isquemia confirmados —cambios en el segmento ST o inversiones de la onda T—), y d) grupo con infarto agudo de miocardio (IAM) (n=29; criterios de inclusión: infarto de miocardio confirmado por un aumento significativo de la concentración sanguínea de troponina I y creatincinasa).

El criterio de agrupación se basó en un estudio previo de Lin et al.19. Se excluyó a los pacientes que habían sufrido IAM en los 3 meses previos o angina inestable durante el mes anterior20. También se excluyó a los pacientes con indicios de enfermedad concomitante significativa, en particular cardiopatía valvular hemodinámica, miocardiopatía, enfermedades malignas conocidas y fiebre21. Médicos con una amplia experiencia clínica establecieron el diagnóstico. Se utilizó la puntuación de Gensini para evaluar la estenosis en las arterias coronarias. El algoritmo detallado de las puntuaciones de Gensini ya fue explicado con anterioridad por Ye et al.22.

Los propios pacientes proporcionaron el consentimiento informado por escrito y el Comité Ético del Hospital Popular de la Región Autónoma Zhuang de Guangxi aprobó el protocolo del estudio.

Las muestras de sangre se obtuvieron a la llegada del paciente a urgencias. Estas se recogieron antes de realizar la angiografía coronaria y de proporcionar cualquier tipo de tratamiento. El tiempo de inicio fue <6 h en todos los pacientes. Las muestras se centrifugaron a 4.000g durante 20min y a continuación se recogió el sobrenadante y se conservó a−80°C hasta el comienzo de los experimentos. Se retiraron las muestras del medio a−80°C y a continuación se descongelaron a temperatura ambiente. Las concentraciones plasmáticas de IL-5 (R&D Systems), IL-17 e IFNγ (ambos de eBioscience) se determinaron con un kit de análisis de inmunoadsorción enzimática (ELISA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se anestesió a machos adultos de ratón C57BL/6 con isoflurano al 2% y se les separó el bazo. La suspensión esplénica de una sola célula se preparó y cultivó en medio de cultivo completo RPMI 1640 (Gibco). El grupo de diferenciación de células Th4 (CD4+) se obtuvo mediante selección positiva utilizando perlas magnéticas CD4 (Miltenyi Biotech) y un separador de células activadas por magnetismo23. Tras la activación por medio de anti-CD3 y anti-CD28 (ambos de eBioscience), las células CD4+Th se trataron con lipoproteína oxidada de baja densidad (50 μg/ml, Servicebio) o con IL-5 recombinante de ratón (rIL-5, Genetex). A continuación se cultivaron las células en una incubadora humidificada de CO2 con CO2 al 5%, a 37°C durante 24 h24,25.

Se obtuvieron las células CD4+Th cultivadas previamente y se tiñeron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD4 (FITC-CD4). Tras tratamiento con concentrado de fijación/permeabilización, se tiñeron las células con ficoeritrina (PE) marcada con anti-IFNγ (PE-IFNγ) y PE marcada con anti-IL-17 (PE-IL-17). Se incluyeron los controles de isotipo para compensar y confirmar la especificidad de los anticuerpos. Las células Th1 se definieron como CD4+/IFNγ+ y las Th17, como CD4+/IL-17+. Las mezclas de estimulación celular y todos los anticuerpos de citometría de flujo se adquirieron en eBioscience y se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las concentraciones plasmáticas de citocinas y las características clínicas se expresan en mediana [intervalo intercuartílico] y se compararon con la prueba de la U de Mann-Whitney. Las correlaciones entre la IL-17, el IFNγ, las características clínicas y la IL-5 se analizaron utilizando el coeficiente de correlación de Spearman. El análisis de regresión lineal simple y el posterior análisis de regresión lineal binario se utilizaron para determinar si la IL-5 es un biomarcador independiente de la EC. Los valores del cultivo celular expresan media±desviación estándar y se compararon con las pruebas de la t de Student. Todos los datos se analizaron con el software SPSS 23.0, y se consideró estadísticamente significativo un valor de p <0,5.

Entre los pacientes que proporcionaron tejido coronario, los valores de troponina cardiaca I (TncI) y proteína C reactiva eran considerablemente más altos en los grupos con EC que en el grupo de donantes fallecidos. No se observaron diferencias entre los grupos en lo que respecta a otras características clínicas, tales como edad, sexo, fumar, beber, presión arterial sistólica (PAS), glucosa (Glu) en ayunas, colesterol total (CT), triglicéridos (TG), lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de alta densidad (HDL) y presión arterial diastólica (PAD). Los datos clínicos se enumeran en la tabla 2.

Había significativamente menos IL-5 en la placa coronaria de los pacientes con EC que en la de los donantes fallecidos (figura 1A y B). La IL-5 procedía tanto de las células CD4+Th como de los macrófagos, si bien estos constituían la fuente principal (figura 1C y D).

Figura 1.

Expresión y fuente de IL-5 en tejido coronario humano. A: la concentración de IL-5 en la placa coronaria de los pacientes con EC y en los donantes fallecidos se determinó mediante inmunotransferencia. B: la concentración de ARNm de la IL-5 en estos 2 grupos se determinó mediante RT-qPCR. C y D: la fuente de IL-5 se analizó mediante tinción doble por inmunofluorescencia en tejido coronario (×400). CD: antígeno CD o de diferenciación; EC: enfermedad coronaria; GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; IL: interleucina; RT-qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa tras transcriptasa inversa. *p <0,05.

(0,26MB).

Los valores de Glu, CT, PAS, LDL, PCR y TncI eran considerablemente inferiores en el grupo sin EC que en los otros 3 grupos. Otras características clínicas, tales como la edad, el sexo, fumar y beber, los TG, las HDL y la PAD, no mostraban diferencias evidentes. Ninguna de las características clínicas era claramente distinta entre los grupos con angina estable, con angina inestable y con IAM, excepto la PAS y la TncI. La PAS y los valores de TncI más altos eran los del grupo con IAM, más altos que en el grupo con angina inestable, y los más bajos eran los del grupo con angina estable. Los datos clínicos se enumeran en la tabla 3.

Los resultados del ensayo ELISA mostraban que las concentraciones de IL-5 disminuían de manera gradual en los grupos sin EC, con angina estable y con angina inestable, mientras que no se observaban diferencias entre los grupos de angina inestable y de IAM (figura 2A). Las concentraciones de IL-17 y de IFNγ aumentaron gradualmente en los grupos sin EC, con angina estable, con angina inestable y con IAM (figura 2B y C). El coeficiente de correlación de Spearman mostró que las concentraciones de IL-5 se correlacionaban negativamente con las de IL-17 e IFNγ en los pacientes con EC (figura 2D y E). Además, las concentraciones de IL-17 se correlacionaban de forma positiva con las de IFNγ (figura 2F).

Figura 2.

Citocinas en pacientes con enfermedad coronaria. Concentraciones plasmáticas de IL-5 (A), IL-17 (B) e IFNγ (C) en los grupos sin EC y con EC. Correlaciones entre las concentraciones de IL-5 (D), IL-17 (E) e IFNγ (F). Correlaciones entre la puntuación de Gensini y las concentraciones plasmáticas de IL-5 (G), IL-17 (H) e IFNγ (I). EC: enfermedad coronaria; IAM: infarto de miocardio; IFNγ: interferón gamma; IL: interleucina.

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Se detectó que la correlación entre las concentraciones de IL-5, IL-17 e IFNγ y las puntuaciones de Gensini también determinaba si las 3 citocinas se relacionaban con la gravedad de la EC. Los resultados mostraron que la puntuación de Gensini tenía una correlación positiva con las concentraciones de IL-17 e IFNγ, pero negativa con las de IL-5 (figura 2G-I).

Los resultados del análisis de regresión lineal simple mostraban que la IL-5, la IL-17, el IFNγ, la TncI, el CT, las LDL y la Glu tendían a establecer correlación con la prevalencia de EC (p <0,05). Luego se analizaron las 3 citocinas y las 4 características clínicas mediante análisis de regresión lineal binario, y los resultados mostraron que la IL-5 (β=−0,273; intervalo de confianza del 95% [IC95%], −0,455 a −0,091; p=0,003), la IL-17 (β=0,228; IC95%, 0,068-0,388; p=0,006) y el IFNγ (β=0,232; IC95%, 0,081-0,382; p=0,003) se asociaban con la presencia de EC (tal como se muestra en la tabla 4).

Los resultados del análisis de citometría de flujo mostraron que el tratamiento con lipoproteínas de baja densidad oxidadas aumentaba considerablemente los porcentajes de Th1 y Th17, mientras disminuía el número de células T reguladoras (Treg) (figura 3A-D). Estos efectos podrían invertirse con rIL-5. El ARNm de las citocinas Th1 y Th17 características, como el IFNγ, el TBX21, la IL-18, el RORγT, la IL-17 y la IL-23, mostraba tendencias similares a las de las células Th1 y Th17 respectivamente (figura 3E).

Figura 3.

Efecto de la IL-5 en la diferenciación in vitro de Th1, Th17 y Treg. A: se identificaron células Th1 y Th17 entre las CD4+Th en función de su expresión de CD4+IFNγ+ y CD4+IL-17+ respectivamente. Valores de Th1 (B), Th17 (C) y Treg (D) en los grupos de control, OX-LDL y OX-LDL+rIL-5. E: las concentraciones de ARNm de IFNγ, TBX21, IL-18, RORγT, IL-17, IL-23 e IL-35 en los 3 grupos se determinaron mediante RT-qPCR. CD: antígeno CD o de diferenciación; IFNγ: interferón gamma; IL: interleucina; OX-LDL: lipoproteínas de baja densidad oxidadas; PE: ficoeritrina; rIL-5: IL-5 recombinante de ratón; RoRγ: receptor huérfano gamma relacionado con el receptor de ácido retinoico; RT-qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa tras transcriptasa inversa; TBX: factor de transcripción caja T; Th: células T helper; Treg: célula T reguladora. ap < 0,05 frente a grupo control. bp < 0,05 frente a grupo OX-LDL.

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Primero, se requiere un modelo experimental de enfermedad cardiaca isquémica o infarto en animales para mostrar el efecto deletéreo de la IL-5KO o el efecto positivo de la estimulación in vivo de IL-5. Segundo, el tamaño de la muestra del estudio es insuficiente y se requieren más pacientes para validar los resultados. Tercero, los pacientes hospitalarios que participaron en el estudio pueden haber causado sesgo de selección, ya que en general se considera que su enfermedad es más grave. Por último, se constató una falta de visitas de seguimiento en los pacientes con EC.