DESARROLLO CARDIACO Y ORIGEN DEL EPICARDIO

El corazón de los vertebrados es un órgano pulsátil complejo, cuyo correcto funcionamiento es esencial para el desarrollo y mantenimiento de la vida del animal, incluso en etapas embrionarias tempranas en que su estructura y composición difieren profundamente respecto a su organización definitiva. Su estructuración en cámaras —que responde, en esencia, a la necesidad de recibir la sangre y propulsarla, minimizando el flujo retrógrado— difiere entre grupos y constituye una importante adaptación hacia la mejora de la eficiencia mecánica, lo que resulta en un gran avance en comparación con las bombas impulsoras lineales o vasos peristálticos de otros cordados1. A pesar de estas diferencias estructurales, en todos los vertebrados el corazón consta de una pared muscular miocárdica de grosor variable, tapizada internamente por una cubierta de células endocárdicas y externamente por el epicardio.

Desde el punto de vista ontogénico, el corazón de los vertebrados está constituido principalmente por tejido mesodérmico, originado durante la gastrulación con la ingresión de células a partir del epiblasto y su posterior migración anterolateral para dar lugar a los campos precardiacos bilaterales2. Debido a las fuerzas mecánicas originadas por el cierre del portal intestinal anterior y el plegamiento general del embrión, los campos bilaterales se mueven hacia la línea media, donde se reunirán para dar lugar a un tubo cardiaco primitivo único constituido por una capa interna de células endocárdicas tapizada externamente por una capa de células miocárdicas. Hasta finales de la década de los sesenta se consideró que prácticamente todas las estructuras presentes en el corazón adulto derivaban del tubo cardiaco primitivo3. Sin embargo, varios estudios han demostrado que las células que componen el corazón derivan de dos campos de precursores cardiacos reclutados secuencialmente durante el desarrollo. Las células que componen el tubo cardiaco primitivo dan lugar al ventrículo izquierdo y los atrios, mientras que el ventrículo derecho y el tracto de salida derivan de mesodermo pericárdico, que se añade al tubo cardiaco por medio de sus polos arterial y venoso4. Además del mesodermo pericárdico, las células de la cresta neural también contribuyen a la formación del corazón, que dan lugar al músculo liso de los grandes vasos, participan en la septación del tracto de salida y actúan de forma paracrina sobre algunas poblaciones de miocardiocitos.

Como se ha mencionado anteriormente, el miocardio está recubierto de una capa epitelial denominada epicardio. Entre el epicardio y el miocardio se establece el espacio subepicárdico, rico en matriz extracelular, donde tendrá lugar la aparición de la vasculatura coronaria, uno de los eventos más tardíos en el desarrollo cardiaco. Durante la formación de la vasculatura coronaria se desarrolla un plexo vascular arterial y venoso que se conectará posteriormente a la aorta proximal y al atrio derecho respectivamente. El epicardio, el mesénquima y los vasos coronarios del subepicardio y vasos intramurales se consideraron clásicamente derivados del miocardio primitivo —denotado en origen como epimiocardio, una mezcla de miocardiocitos y células indiferenciadas5—. Aunque se había apuntado a que el epicardio procedía de una fuente mesenquimática extracardiaca, situada cerca del tracto de entrada y que sería capaz de migrar sobre la superficie del corazón6, la idea pasó inadvertida hasta que un detallado estudio del tubo cardiaco primitivo del embrión de pollo demostró la ausencia de células indiferenciadas y evidenció las diferencias citológicas entre miocardio y epicardio primitivo7.

La mayor parte del epicardio deriva de una estructura transitoria denominada proepicardio (PE), que se desarrolla a partir de células del mesotelio celómico a nivel del tracto de entrada8-12. En el embrión de las aves, el PE presenta una estructura en «racimo de uvas» estimada en no más de 200 células (fig. 1A). Si bien la mayor parte del epicardio deriva del PE, una pequeña porción que abarca el tracto de salida más distal se origina a partir del pericardio cefálico13,14. Experimentos recientes de trazado de linaje han mostrado que el PE deriva de la fuente precursora común que genera la mayoría de los tipos celulares del corazón y que, por lo tanto, no representa realmente una estructura extracardiaca. Los precursores cardiacos tempranos pueden ser reconocidos por la expresión de los factores de transcripción Nkx2.5 e Isl1. Las células del PE derivan de una población Nkx2.5+Isl1+, si bien no expresan estos genes15,16. Adicionalmente, estudios de falta de función han demostrado que el PE no se forma correctamente en los ratones mutantes que carecen de Nkx2.5, mientras que Isl1 no parece ser esencial para el desarrollo epicárdico15.

Fig. 1. Representación esquemática del desarrollo del epicardio y de la generación de las células derivadas de epicardio (CDEP). A: vista lateral de la porción anterior de un embrión de pollo que muestra la localización del proepicardio (PE) próxima al tracto de entrada (TE) del corazón. El tubo cardiaco se representa en rojo (adaptado de Pérez-Pomares et al, 2002)41. A': la señalización mediada por FGF2 (azul) es esencial para la especificación del linaje proepicárdico (flecha violeta) y contrarresta la señalización de BMP2 (verde), que dirige la diferenciación del mesodermo pericárdico hacia miocardiocitos del TE (flecha roja). A': la expresión de Tbx18 y de Wt1 puede ser detectada en el proepicardio (violeta). B: en los embriones de aves, la adhesión del PE (violeta) a la superficie del miocardio (rojo) permite la transferencia de las células proepicárdicas al tubo cardiaco. B': en el ratón y la pintarroja, se ha sugerido que agregados de células proepicárdicas se liberan a la cavidad pericárdica y progresivamente se adhieren a la pared del miocardio. C: algunas células del epicardio primitivo experimentan un proceso de transición epitelio-mesénquima (TEM) y se acumulan en el espacio subepicárdico o migran en el interior de la pared miocárdica y se diferencian en células endoteliales, fibroblastos o músculo liso. Estos procesos están controlados de forma autocrina o paracrina (flechas negras discontinuas) por factores expresados por el epicardio, las CDEP o el miocardio. El epicardio también influye en la proliferación de la pared miocárdica (flecha negra). A: aurícula; CDEP: células derivadas de epicardio; mes per: mesénquima pericárdico; M o mio: miocardio; TS: tracto de salida; V: ventrículo.

La especificación de células del mesodermo pericárdico hacia el linaje proepicárdico en el tracto de entrada parece estar controlada por la acción opuesta de FGF2 (fibroblast growth factor 2, factor de crecimiento de fibroblastos) y BMP2 (bone morphogenetic protein 2, proteína morfogénica ósea)17.

El miocardio del tracto de entrada expresa BMP2, que induce la diferenciación hacia miocardiocitos sobre el mesénquima pericárdico, mientras que las células proepicárdicas expresan FGF2. La inhibición experimental de la señalización mediada por FGF2 bloquea la formación del PE, de forma que las células pericárdicas se incorporan al tracto de entrada (fig. 1A'). Este modelo de especificación evidencia la plasticidad y potencialidad del mesodermo pericárdico para dar lugar a componentes miocárdicos y no miocárdicos del corazón. No obstante, no se ha determinado hasta la fecha si este mesénquima representa una población bipotencial (en el que una misma célula es capaz de generar miocardio y epicardio) o si alberga dos poblaciones separadas.

Algunos genes expresados de forma temprana en el PE incluyen los que codifican para la retinal-dehído-deshidrogenasa 2 (Raldh2)18,19, el factor de transcripción T-box 18 (Tbx18)20,21 o la proteína del tumor de Wilm (Wt1)22,23 (fig. 1A''). No obstante, ninguno de estos genes se expresa exclusivamente en el PE o en el epicardio primitivo. La pérdida de función de Raldh2, la enzima principal en la síntesis de ácido retinoico (AR) conlleva graves malformaciones cardiacas. La inactivación del receptor de retinoico RXRα en el PE en mutantes nulos y en mutantes condicionales afecta gravemente al desarrollo epicárdico24,25. Además de en el epicardio, Tbx18 se expresa en la pared celómica del pericardio y parte del miocardio del tracto de entrada. La ausencia de Tbx18 afecta al desarrollo y la especificación de esta región, sin que se haya obtenido hasta la fecha evidencia de su papel biológico en la formación del epicardio26. La expresión de Wt1 en la región cardiaca puede ser detectada inicialmente en las células mesoteliales que tapizan la cavidad pericárdica y posteriormente en el PE y el epicardio primitivo22,23. Los ratones mutantes para Wt1 muestran defectos cardiovasculares letales, especialmente relacionados con el epicardio, su función señalizadora y la formación de sus derivados27-29.

Las células proepicárdicas se adhieren a la superficie del corazón a la altura del canal auriculoventricular y del tracto de entrada y forman una envuelta epitelial que se conoce como epicardio primitivo. Aunque el mecanismo de translocación de estas células a la superficie del miocardio parece variar entre diferentes modelos animales (fig. 1B y B'), en el embrión de las aves la unión del PE a la superficie del miocardio del canal auriculoventricular permite la transferencia de las células proepicárdicas al corazón30-32. Esta adhesión preferencial a determinadas áreas (conservada evolutivamente, independientemente de la modalidad de transferencia) parece radicar en la acumulación de matriz extracelular en la superficie miocárdica, dado que el tratamiento con algunas proteasas impide la unión del PE a la superficie ventricular31. Por el contrario, en un modelo de elasmobranquios (la pintarroja) y un modelo de mamíferos (el ratón) el PE libera agregados de células que se desprenden y se adhieren progresivamente a la superficie miocárdica33,34. Se ha propuesto que este fenómeno está dirigido por el latido cardiaco, que podría promover la unión y la separación alternas entre el PE y la pared miocárdica, lo que da lugar a la formación de agregados que permanecen adheridos a la superficie del tubo cardiaco o que quedan temporalmente libres en la cavidad pericárdica hasta su posterior reasociación35. No obstante, no se puede excluir la posibilidad de que ambos mecanismos coexistan en algunas especies. Por otra parte, no se descarta que otros mecanismos puedan estar involucrados en este proceso, dado que en el ajolote mutante letal, que carece de latido cardiaco, las células proepicárdicas se adhieren al miocardio, si bien su migración sobre la superficie miocárdica parece estar comprometida36. Se ha propuesto que el factor de transcripción Tbx5 puede controlar la migración de las células epicárdicas, dado que en los estudios de ganancia y pérdida de función se ven afectadas la migración y la supervivencia de las células PE37.

Algunas células epicárdicas sufren una transición epitelio-mesénquima (TEM) y delaminan del epicardio primitivo para invadir el espacio subepicárdico38 (fig. 1C). Un estudio reciente ha aportado evidencias moleculares de la implicación de Wt1 en el control transcripcional directo de genes clave en la iniciación de la TEM y, por lo tanto, en la formación de los derivados epicárdicos28. Algunas de las células derivadas de epicardio (CDEP) permanecen como células mesenquimáticas en el espacio subepicárdico, mientras que otras migran entre los miocardiocitos, y en determinadas localizaciones llegan a alcanzar el espacio subendocárdico. La generación de las CDEP por medio de la TEM, su migración y diferenciación parecen estar controladas fundamentalmente por señales paracrinas que provienen del miocardio39,40.

Aunque se trata de un aspecto controvertido, como se discutirá posteriormente, en general se acepta que in vivo las CDEP dan lugar a endotelio y músculo liso de la vasculatura coronaria y los fibroblastos intersticiales, y contribuyen a la formación de las válvulas y el anillo fibroso auriculoventricular, y se ha hipotetizado acerca de su potencial para diferenciarse en miocardiocitos.

EL EPICARDIO COMO FUENTE DE SEÑALES

Diferentes experimentos con embriones de pollo en los que se eliminó el PE o se impidió su adhesión al miocardio han demostrado que el correcto desarrollo del miocardio requiere la presencia del epicardio. En su ausencia, el crecimiento de la capa compacta del miocardio no progresa, y se ven comprometidos el desarrollo de las válvulas auriculoventriculares y el septo interventricular14,41-43. El desarrollo de un epicardio defectuoso conlleva la aparición de protrusiones del miocardio ventricular, lo que indica que el epicardio controla las propiedades mecánicas pasivas de la pared miocárdica43. Notablemente, los efectos de la ablación proepicárdica en el embrión de ave son similares al fenotipo del ratón mutante para el gen Wt1, que presenta una capa compacta miocárdica muy fina, un desarrollo anómalo de las válvulas auriculoventriculares, una septación interventricular incompleta y ausencia de vasos coronarios y otros derivados epicárdicos27,29.

En los últimos años se ha acumulado un importante cuerpo de evidencias que soporta la noción de una señalización paracrina desde el epicardio al miocardio en desarrollo que involucra moléculas como el AR o diferentes FGF. Adicionalmente, se ha demostrado recientemente que los fibroblastos intermiocárdicos, que son, al menos parcialmente, derivados epicárdicos, promueven la proliferación del miocardio durante el desarrollo cardiaco44.

EPICARDIO Y REGENERACIÓN CARDIACA

El papel del epicardio durante la regeneración miocárdica ha atraído un interés creciente en la comunidad científica en los últimos años. En el modelo de regeneración del pez cebra, la resección del ápex ventricular (hasta un 20% del ventrículo) se repara completamente por un recrecimiento de la región amputada, incluidos el miocardio, el tejido endocárdico y la vasculatura coronaria45. Se ha apuntado a que el epicardio tiene un papel importante durante la regeneración del corazón del pez cebra. La amputación del ápex induce una fuerte expresión de marcadores epicárdicos, y células precursoras endoteliales se acumulan en el sitio de amputación46 (fig. 2A). Hasta la fecha, se desconoce si el epicardio contribuye exclusivamente de una forma paracrina, estimulando la proliferación miocárdica o como una fuente de células, proveyendo CDEP que se incorporan a la pared miocárdica. Estudios del epicardio en el pez cebra indican que las CDEP se incorporan al corazón adulto no sólo durante la regeneración, sino que participan en su crecimiento continuo, dado que se ha descrito una expresión muy intensa de marcadores epicárdicos durante el crecimiento rápido en adultos47. La implicación del epicardio durante los procesos regenerativos parece no ser única de los teleósteos. La inducción de un infarto de miocardio en ratones eleva notablemente la expresión de los marcadores Tbx18, Wt1 y Raldh2 en el epicardio48,49 (fig. 2B) y la marcación lentiviral de células epicárdicas indica una participación de CDEP en la regeneración del miocardio dañado que contribuye a la formación de miocardiocitos (fig. 2C). Además, se han detectado células positivas para los marcadores de células madre c-kit y CD34 en el espacio subepicárdico de corazones fetales o adultos humanos50. En cultivo, estas células expresan marcadores propios de miocardiocitos, células endoteliales y células musculares lisas en el caso de explantes murinos, y de células musculares lisas en el caso de muestras de corazones humanos51 (fig. 2D). En un estudio reciente, el trasplante de CDEP humanas en el corazón de ratones tras una oclusión coronaria resultó en una mejora significativa de la función cardiaca: esto demostró que hay un potencial terapéutico genuino de las CDEP en la restauración de la función cardiaca tras un infarto de miocardio52, si bien se desconoce el tipo celular al que dieron lugar o si su efecto fue exclusivamente paracrino.

Fig. 2. Papel del epicardio durante la regeneración cardiaca. A: la resección del ápex ventricular (línea azul) promueve la reexpresión de factores de transcripción característicos del desarrollo del epicardio en la superficie del corazón adulto en pez cebra (línea violeta). B: la generación de un daño isquémico en corazón de ratón adulto induce la reexpresión de Tbx18, Raldh2 y Wt1 en una subpoblación de células epicárdicas o en sus derivados (línea violeta discontinua; véase detalle). C: el trazado lentiviral de las células del epicardio adulto mediante la expresión de GFP (verde) indica la contribución del epicardio a la regeneración del miocardio tras un daño isquémico inducido (véase detalle). D: potencialidad in vitro de células epicárdicas humanas c-kit+/CD34+. A: aurícula; ai: área infartada; BA: bulbo arterioso; dpa: días tras la amputación; enc: endocardio; epi: epicardio; mio: miocardio; pa: plano de amputación; V: ventrículo.

Dada su posible aplicación terapéutica para el tratamiento del infarto de miocardio, se están realizando numerosos estudios para la reactivación del epicardio y la inducción de la TEM. Recientemente se ha descrito el efecto de diferentes moléculas en la migración y proliferación del epicardio y las CDEP. La administración de timosina β4 induce la reexpresión de marcadores epicárdicos embrionarios y favorece la formación de capilares en la zona borde del infarto en ratones adultos tras la ligación de una arteria coronaria53. Actualmente se está investigando el efecto de la administración de FGF y VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular, vascular endothelial growth factor) en la angiogénesis después de un daño miocárdico de isquemia-reperfusión54. Resulta esencial, en virtud de todo ello, comprender el linaje de las CDEP durante el desarrollo y la regeneración a fin de esclarecer su potencial real y conocer las señales que permiten su diferenciación a distintos tipos celulares. A continuación se detallan los distintos abordajes experimentales utilizados hasta la fecha para estudiar el destino de CDEP y se discuten los resultados obtenidos. Además, se presentan técnicas alternativas para el estudio del linaje epicárdico que ayudarán a esclarecer su importancia durante el desarrollo y la regeneración.

MÉTODOS DE TRAZADO DE LINAJE

Los estudios de trazado de linaje permiten entender los procesos de morfogénesis y proporcionan información sobre las relaciones genealógicas de células dentro de una estructura. El estudio del trazado de linaje se puede realizar mediante el aislamiento de células precursoras y su cultivo in vitro o mediante su trazado in vivo.

En biología del desarrollo se ha usado clásicamente el sistema de quimerización heteroespecífica codorniz-pollo para estudiar el linaje de distintos tipos celulares durante la organogénesis in ovo. Esta técnica se basa en el trasplante de tejido de un embrión de codorniz (donante) a un embrión de pollo (aceptor). Las células del donante se pueden reconocer posteriormente mediante el empleo de anticuerpos específicos que reconocen antígenos propios de la codorniz ausentes en el pollo, y así estudiar su contribución durante el desarrollo de un órgano determinado. Alternativamente, se puede realizar la marcación celular mediante el uso de agentes fluorescentes lipófilos, como la carbocianina DiI, que se incorporan a la membrana de la célula y permiten su seguimiento durante un corto periodo del desarrollo del animal. Otra técnica usada frecuentemente en aves es la marcación con retrovirus defectivos en replicación que portan una construcción reporter LacZ. Esta estrategia permite determinar el destino final de las células infectadas mediante tinción con el sustrato de la enzima betagalactosidasa (codificada en el genoma viral), que produce un precipitado coloreado. Si este experimento se realiza usando un título viral bajo, se obtiene un número de clones que, con una alta probabilidad, descienden de una única célula infectada, permitiendo el estudio de la pluripotencialidad de una célula precursora y el momento de su especificación de linaje55.

En el ratón, la técnica de trazado de linaje usada con más frecuencia56,57 se basa en la tecnología Cre-loxP. La proteína Cre es una recombinasa de la superfamilia de las integrasas λ originalmente presente en el bacteriófago P1 de Escherichia coli. Aunque se trate de una enzima viral, se ha demostrado que funciona eficientemente en células eucariontes58. Junto con la transgénesis y el gene targeting son una herramienta muy importante para la investigación genética en el ratón, que permite desarrollar, por ejemplo, modelos de ganancia o pérdida de función condicional. Las proteínas Cre reconocen unas secuencias diana en el ADN, denominadas loxP. Estas secuencias tienen una estructura única palindrómica repetida a ambos lados de una secuencia central. La asimetría de la secuencia central les confiere una orientación. Las dos dianas loxP presentes en diferentes lugares del ADN se cortan por la parte central y vuelven a recomponerse intercambiando las mitades. Así, el resultado obtenido será diferente dependiendo de la orientación de las dianas y de su presencia en una misma o en distintas moléculas de ADN: en el primer caso, se eliminará el fragmento situado entre las dos dianas (fig. 3A), y en el segundo, se intercambiarán los fragmentos de ADN presentes en las distintas moléculas (fig. 3B)59. Varios estudios han mostrado que la actividad de un gran número de proteínas puede controlarse gracias a su fusión al dominio de unión a ligando del receptor nuclear de estrógenos (ER). En ausencia del ligando (betaestradiol), el receptor de estrógenos permanece retenido en el citoplasma de la célula mediante su asociación al citoesqueleto de actina60. El 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) es un análogo sintético del estradiol que se une al dominio ER. Debido a diferencias estructurales con el ligando natural, la unión de 4-OHT produce ciertos cambios conformacionales en el dominio ER, impidiendo el reclutamiento de coactivadores por parte de éste61. Mediante la mutación de este dominio62,63 se han conseguido las variantes ERT y ERT2, que presentan una afinidad muy reducida por el ligando natural (betaestradiol) y una afinidad aumentada por el 4-OHT, y conservan intacta la capacidad de regulación de la localización subcelular del dominio silvestre. De este modo, un organismo transgénico que exprese de forma estable la recombinasa Cre fusionada al dominio ERT (Cre-ERT) no presenta actividad Cre apreciable. Únicamente tras la administración de 4-OHT y sólo durante el tiempo que tarda en eliminarse el fármaco, la recombinasa Cre se translocará al núcleo y estará activa. Localizando el gen Cre-ERT bajo el promotor específico de un tipo celular determinado se obtiene un control tanto espacial como temporal de su actividad, que se ve limitada a los periodos en que se administre el 4-OHT.

Fig. 3. Sistema Cre-loxP. A: eliminación por acción de la recombinasa Cre de un fragmento de ADN comprendido entre dos secuencias loxP situadas en el mismo sentido de una molécula. B: la unión de la recombinasa Cre a dos dianas loxP situadas en moléculas de ADN diferentes producirá el intercambio de fragmentos entre las dos moléculas.

Una de las aplicaciones importantes de este método es su combinación con el de las líneas reporter. De este modo se puede observar la restricción de tejido o de linaje como consecuencia de la recombinación, gracias a un marcador, de forma permanente y transmisible a su descendencia64-66. Una de las primeras líneas de ratón reporter se obtuvo por modificación genética dirigida del locus ROSA26 (reverse orientation splicing acceptor). Este locus se utiliza para conseguir la expresión ubicua y homogénea de un transgén en el embrión de ratón o en el adulto67. En caso de que haya actividad Cre, cada célula del animal expresa un marcador de forma permanente y transmisible a su descendencia. Los marcadores más utilizados son el LacZ64 y la proteína fluorescente mejorada EGFP (verde)66, así como la EYFP (amarilla) y la ECFP (cian), obtenidas a partir de mutaciones de ésta68.

La técnica Cre-loxP se ha utilizado para realizar estudios de trazado de linaje en el corazón, mediante el control transcripcional de la enzima Cre bajo el promotor de genes con expresión específica en diferentes tipos celulares o regiones del corazón. De este modo, usando las líneas Isl1-Cre o Nkx2.5-Cre se puede estudiar el linaje de poblaciones de progenitores cardiacos69-71. La línea αMHC-MerCreMer, por ejemplo, permite la activación controlada de la Cre recombinasa en el miocardio72 y la línea Nppa-Cre restringe su expresión a miocardiocitos auriculares73. Con la línea Wnt1-Cre se puede estudiar la distribución de los derivados de la cresta neural cardiaca74, mientras que la línea Tie2-Cre permite el trazado del linaje endocárdico75. Mediante el uso de las líneas αMHC-Cre, Tie2-Cre y Wnt1-Cre se ha estudiado la formación de las válvulas cardiacas, confirmando que derivan del endocardio76. Como se mencionará también más adelante, el linaje epicárdico se ha trazado mediante líneas que expresan Gata5-Cre, Wt1-Cre o Tbx18-Cre15,16,24,77,78.

Una alternativa al uso de la recombinasa Cre es la técnica que utiliza el reporter LacZ portador de una duplicación intragénica no funcional (nLaacZ). Cuando nLaacZ sufre un evento espontáneo de recombinación intragénica, se convierte en la forma funcional nLacZ, que será transmitida de manera estable a la descendencia. El empleo de esta técnica de trazado de linaje de baja frecuencia ha permitido recientemente estudiar las relaciones de linaje de diferentes poblaciones miocárdicas con resolución clonal79-81. De igual manera, el uso de la recombinación mediada por Cre a baja frecuencia de recombinación permite el análisis clonal, ya que potencialmente posibilita la obtención de células marcadas descendientes de una única célula.

APLICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE TRAZADO CLÁSICOS AL ESTUDIO DEL EPICARDIO

Clásicamente, el epicardio se había considerado una capa inerte de recubrimiento, cuyo único cometido era la protección mecánica de la superficie miocárdica. Sin embargo, estudios destinados a descifrar el origen y el desarrollo de la vasculatura cardiaca aportaron las primeras evidencias de su implicación en la morfogénesis coronaria. La caracterización inicial del epicardio primitivo permitió describir la presencia de islotes sanguíneos y de infiltrados mesenquimáticos subepicárdicos, sin que se especificara ni discutiera su origen82-84.

Gran parte del conocimiento sobre la formación del epicardio y sus derivados proviene de estudios en embriones de aves (fig. 4A). Uno de estos estudios pioneros —destinado inicialmente a establecer si el desarrollo de las coronarias se producía por la conexión de una red de capilares a la base de la aorta (ingrowth) o si éstos procedían de un sobrecrecimiento de la base de ésta (outgrowth)— empleando la marcación retroviral aportó las primeras evidencias de que los precursores de la vasculatura coronaria ingresan en el corazón vía el mesotelio dorsal. La inyección de partículas retrovirales en la cavidad pericárdica de embriones de pollo resultó en la marcación de componentes de la vasculatura coronaria (músculo liso y endotelio) y de fibroblastos intersticiales. Para estudiar si estos tres tipos celulares provenían de un mismo progenitor celular, se procedió a realizar infecciones a bajo título viral. Estas condiciones experimentales nunca produjeron clones que contuviesen estas tres poblaciones, lo que indica que los progenitores estaban especificados de forma temprana85. En un estudio posterior, la marcación retroviral se realizó exclusivamente en el PE de embriones de pollo86, lo que permitió concluir que esta estructura daba lugar al epicardio, células mesenquimales subepicárdicas, músculo liso y células endoteliales de la vasculatura coronaria, así como pericitos y fibroblastos intersticiales del miocardio. Además, los autores detectaron células positivas para marcadores de músculo liso y endotelio vascular en el PE y no obtuvieron clones mixtos con contribución de diferentes tipos celulares en inyecciones a bajo título viral, lo que apoya la hipótesis de especificación temprana y monoclonalidad de las CDEP. La marcación de las células proepicárdicas con DiI confirmó su contribución al epicardio y la posterior infiltración del miocardio por un subgrupo de éstas86. La contribución de células proepicárdicas a músculo liso y endotelio vascular de las coronarias se confirmó con estudios que empleaban el sistema de quimerización heteroespecífica codornizpollo87,88. Sin embargo, un tercer estudio de trazado con este sistema indicó que las células endoteliales de las coronarias proceden del primordio hepático en desarrollo y no del PE89, si bien ingresan en el corazón a través del puente que éste establece con el miocardio90.

Fig. 4. Destino de las CDEP en el pollo (A) y en el ratón (B) (células azules). enc: endocardio; ent: endotelio; epi: epicardio; fib: fibroblastos; mio: miocardio; ml: músculo liso.

Estudios más recientes en el ratón mediante la tecnología Cre-loxP han examinado el destino de los precursores epicárdicos que expresan Wt1 o Tbx1816,77,78 (fig. 4B). En el primer abordaje, se generó una línea de ratón Tbx18-Cre, que se cruzó con la línea reporter ROSA26-LacZ. Estos experimentos han confirmado que la musculatura lisa, los pericitos de los vasos coronarios, parte de los fibroblastos del intersticio cardiaco y de las válvulas mitral y tricúspide proceden de una población Tbx18+. Sin embargo, y a diferencia de los resultados de trazado clásico en aves, estos experimentos mostraron una contribución al linaje miocárdico (especialmente en el septo interventricular [30%] y en menor medida en las paredes de ventrículos y aurículas). Un segundo estudio con una línea inducible Wt1-Cre-ERT2 confirmó los resultados obtenidos con la línea Tbx18-Cre, si bien mostró leves diferencias en las proporciones de miocardiocitos derivados de la población Wt1+ (el 10% de miocardiocitos del septo interventricular, el 14% en ventrículos y el 18% en aurículas). En ambos estudios la contribución al endotelio de las coronarias fue minoritaria. La tinción del epicardio de embriones de ratón con colorantes fluorescentes y el posterior análisis de la colocalización de las células trazadas con marcadores miocárdicos confirma estos resultados. Recientemente se ha mostrado que células Wt1+ pueden dar lugar al anillo fibroso auriculoventricular que aísla eléctricamente aurículas y ventrículos77.

LIMITACIONES DE LOS ABORDAJES ACTUALES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LINAJE DE CDEP DURANTE EL DESARROLLO Y LA REGENERACIÓN CARDIACA

Las distintas estrategias empleadas en el estudio del linaje de las CDEP presentan notables discordancias entre los resultados. Si bien estas divergencias pueden deberse al uso de diferentes técnicas de trazado de linaje, no debe descartarse la posible variación debida al empleo de modelos animales distintos.

En primer lugar, los trasplantes heterotípicos, aunque informativos, tienen un potencial muy limitado. Una crítica importante es la dificultad o imposibilidad de generar trasplantes que carezcan por completo de contaminaciones con tejido circundante que permitan, en consecuencia, trazar una población homogénea determinada. Esta limitación condiciona igualmente las aproximaciones retrovirales o el empleo de sustratos fluorescentes, en las que no se asegura que sólo resulte marcada el área de interés. En este sentido es importante destacar que la metodología de quimerización heteroespecífica, la marcación fluorescente o la infección retroviral no resultan de especial utilidad para diferenciar entre las posibles contribuciones del PE comparado con el mesotelio hepático, dada su proximidad anatómica, las limitaciones de la microcirugía o la dificultad en la marcación de células de una población excluyendo otra.

El empleo de líneas Cre-loxP dirigidas por un promotor específico de tejido ha sido de gran utilidad para la caracterización del desarrollo cardiovascular. Para usar esta técnica como método de trazado de linaje es indispensable disponer de un gen cuya expresión sea específica de los precursores de un determinado tipo celular. Sin embargo, aunque la expresión de la recombinasa Cre bajo un promotor determinado permite el trazado del linaje de las células que expresan el gen en cuestión, no necesariamente refleja sólo el linaje del tejido donde se expresa ese gen. En el caso del epicardio, Tbx18 se expresa en el PE y el epicardio, pero también en algunas áreas miocárdicas, lo que supone que el análisis de la descendencia de células Tbx18+ no equivale al estudio de la descendencia de células derivadas del epicardio91. Además, no todas las células proepicárdicas expresan Tbx18 o Wt1, de manera que, de forma independiente, las líneas Wt1-Cre y Tbx18-Cre no reflejan la progenie proepicárdica en su totalidad. De esta forma, las diferencias encontradas entre las dos líneas pueden deberse a que las poblaciones Tbx18+ y Wt1+ no se solapan completamente. Por otra parte, y a diferencia de algunos de los experimentos realizados en el pollo, los estudios en el ratón han evidenciado que tan sólo una población muy pequeña del endotelio vascular coronario procede del epicardio. Se ha descrito una población de células Tbx18- que expresa el marcador endotelial Flk1 en el PE de ratón, lo que indica que diferentes poblaciones celulares derivadas del mesotelio coexisten en esta estructura78. Además, esta población podría representar los angioblastos hepáticos que potencialmente migran a través del PE, y que darían lugar a las células endoteliales de la vasculatura, mientras que las células proepicárdicas contribuirían a los fibroblastos intersticiales y la musculatura lisa89. En cualquier caso, la falta de una línea Cre específica de epicardio es actualmente una limitación clara para el estudio del linaje epicárdico en ratones.

El uso del sistema nLaacZ tampoco ofrece mayores ventajas para el estudio del trazado de linaje epicárdico. Dado que este sistema se basa en el revelado de clones bajo el control de un promotor específico de tejido, sólo revela parte del clon, excluyendo las relaciones de linaje entre estas células y sus hermanas en tejidos adyacentes. Se pierde así parte de la información genealógica de las células que componen un clon.

Como consecuencia de estas limitaciones, el conocimiento disponible en este momento no sólo es fragmentario, sino que muchos de los conceptos aceptados tradicionalmente están sujetos a serias dudas. Respecto a los mecanismos de mantenimiento y regeneración de los tejidos adultos92, el panorama es aún más incierto. Las recientes identificaciones de distintas poblaciones de células troncales residentes o importables al tejido cardiaco no se han acompañado de demostración funcional de su implicación en la renovación del tejido ni durante su homeostasis en condiciones fisiológicas ni durante la regeneración de lesiones. La necesidad de conocer el patrón de renovación celular del corazón adulto, saludable o enfermo, así como de determinar el origen de poblaciones de células troncales que pudieran realizar una función de mantenimiento y reparación natural del tejido cardiaco, es de altísima prioridad hoy en día, tanto para la ciencia básica como para la investigación traslacional. Resultados recientes apuntan a la posibilidad de que el miocardio adulto se renueve parcialmente durante su crecimiento normal o en condiciones de estrés por infarto o sobrecarga patológica93,94. Sin embargo, se desconoce el origen de las poblaciones celulares que pudieran ser la causa de esta renovación miocárdica. De igual manera, en los casos en que se han ensayado terapias celulares en aplicaciones clínicas, los beneficios de la inyección de células han sido marginales y no han ido acompañados de la incorporación funcional de las células trasplantadas95. Será, por lo tanto, esencial profundizar en el entendimiento de mecanismos que permitan a las células colonizar eficiente y funcionalmente órganos adultos para conseguir estrategias eficaces de terapia celular en el futuro.

PERSPECTIVAS FUTURAS

Mientras que las técnicas de embriología clásica empleadas en los modelos de anfibio y aves posiblemente han alcanzado su desarrollo máximo y, por lo tanto, no se esperan avances cualitativos en estos modelos, es evidente que las aproximaciones genéticas en modelos como el ratón o el pez cebra se encuentran en una fase intensa de desarrollo y se pueden esperar contribuciones importantes en un futuro próximo. Las dos limitaciones señaladas anteriormente, la poca fiabilidad o ausencia de promotores idóneos y la policlonalidad de las marcas inducidas, impiden actualmente abordar una descripción exhaustiva del potencial de los precursores cardiacos en diferentes tejidos y estadios.

Una opción relevante en esta área es el abordaje de análisis clonal in vivo mediante un marcado de linaje al azar a baja frecuencia. Esta aproximación, que resumimos a continuación, tiene el potencial de establecer un mapa exhaustivo de la historia celular del sistema cardiovascular en general y del epicardio en particular, tanto durante la embriogénesis como en la homeostasis fisiológica y patológica. La aproximación se basa en la combinación de una Cre recombinasa inducible por tamoxifeno (CreERT2) dirigida por un promotor ubicuo y dos reporter simultáneos independientes (LacZ y EYFP) (fig. 5A). La administración del fármaco (4-OHT) a hembras gestantes cuyos embriones portan ambos transgenes en condiciones limitantes produce la recombinación y activación de uno de los dos reporter en células al azar en el embrión. La cantidad de células recombinadas es dependiente de la dosis de 4-OHT que se administra. Una vez se produce la recombinación, la célula y toda su descendencia quedan marcadas permanentemente. Gracias a la expresión ubicua tanto del transgén como del reporter, el sistema es válido para estudios de trazado de linaje en cualquier estadio embrionario o durante la vida adulta, y puede aplicarse a cualquier órgano o tejido. El sistema tiene los requisitos necesarios para un análisis clonal informativo, ya que ofrece la posibilidad de inducir dos marcas independientes heredables en células al azar con control temporal y de frecuencia de marcación. Además, la utilización de dos marcas independientes permite determinar el origen común o independiente de varios linajes celulares, al ser marcados por el mismo o un distinto reporter. Esta técnica puede utilizarse para analizar la distribución topológica de las células pertenecientes a un mismo clon.

Fig. 5. Análisis clonal con doble reporter. A: cruce de animales transgénicos portadores de una combinación de Cre recombinasa inducible por tamoxifeno (Cre-ERT2) dirigida por un promotor ubicuo y dos reporter independientes (LacZ y YFP). En ausencia de una inducción, la Cre-ERT2 se encuentra inactiva dada su unión a la proteína hsp90 (heat shock protein 90), que produce su retención en el citoplasma. En esta situación, los genes LacZ y YFP no se expresan. La activación de la recombinasa Cre-ERT2 se induce mediante administración de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). La unión de 4-OHT al dominio ERT2 anula la retención citoplasmática de la Cre-ERT2 y produce su translocación nuclear. En el núcleo, la recombinasa se une a sus dianas loxP, produce su recombinación y permite la expresión del reporter LacZ o YFP. Vistas lateral izquierda (B) y derecha (C) de dos corazones embrionarios de ratón a 9,5 días de gestación. B: inducción a alta frecuencia. Nótese la presencia de clones LacZ+ (células azules) y GFP+ (células marrones) en diversas regiones del corazón. C: inducción a baja frecuencia. Se pueden apreciar las células derivadas de un único clon GFP+ (color marrón) en el epicardio (indicado con una flecha) y el proepicardio (PE). A: aurícula; epi: epicardio; ERDB: oestrogen receptor binding domain; PE: proepicardio; V: ventrículo.

Mediante esta técnica se ha podido definir la contribución de los linajes celulares durante el crecimiento y formación del patrón de los primordios embrionarios en el ratón. Esta aproximación se ha demostrado eficiente para determinar bordes de restricción de linaje, como el que define dos compartimentos en las mitades ventral y dorsal del mesénquima de la extremidad de vertebrados en desarrollo, y para el trazado de linajes celulares96.

La técnica del doble clon permitirá estudiar el origen del epicardio, trazar el linaje de las CDEP durante el desarrollo y aclarará las discrepancias y controversias actuales en este campo, permitiendo establecer relaciones de linaje sin las limitaciones impuestas por promotores específicos y con el escrutinio de todas las poblaciones celulares de manera no sesgada (fig. 5B). De igual manera, la aplicación de esta técnica en corazones adultos permitirá estudios similares durante la homeostasis y situaciones patológicas del órgano. Aunque clásicamente el corazón en mamíferos se ha considerado un órgano posmitótico, recientes estudios han demostrado una tasa de renovación de miocardiocitos en el adulto97. El estudio de la dinámica de expansión o supervivencia a largo plazo de clones compuestos exclusivamente por células de miocardio diferenciado permitirá medir su tasa real de renovación y explorar los mecanismos implicados en este proceso. Experimentos similares en animales sometidos a ejercicio intenso e inducción experimental de enfermedad cardiaca permitirán identificar la existencia y el origen tisular de poblaciones celulares naturales capaces de regenerar el miocardio tras una lesión. Diversos estudios apuntan a un papel del epicardio en promover la proliferación de miocardiocitos o incluso participar en la regeneración cardiaca como fuente de células precursoras. La técnica del doble clon será de gran utilidad para entender mejor el papel del epicardio durante los procesos de regeneración cardiaca y permitirá analizar posibles coincidencias entre el epicardio y otros tipos celulares que puedan representar poblaciones renovadoras del corazón. Además, también ayudará a esclarecer el papel del pericardio en el corazón adulto. La apertura del saco pericárdico induce la adhesión del pericardio al miocardio98. Además, estudios de ablación epicárdica han descrito puentes de unión entre el miocardio y el pericardio43. Será interesante estudiar si el mesotelio celómico retiene el potencial de contribuir a células cardiacas en la homeostasis y la regeneración del corazón adulto. Todos estos estudios podrían promover prometedoras oportunidades clínicas en el diseño de terapias regenerativas del sistema cardiovascular.

DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES

Los autores han declarado no tener ningún conflicto de intereses.

ABREVIATURAS

4-OHT: 4-hidroxitamoxifeno.

CDEP: células derivadas de epicardio.

CreERT2: Cre recombinasa inducible por tamoxifeno.

EYFP: enhanced yellow fluorescent protein (proteína amarilla fluorescente mejorada).

PE: proepicardio.

Financiación: Ministerio de Ciencia y Educación (N.M., RYC-2006-001694 y BFU2008-00212/BMC; J.M.G.-R., FPU AP2008-00546) y Fundación ProCNIC.

Correspondencia: Dr. M. Torres.

Departamento de Biología del Desarrollo Cardiovascular. CNIC. Melchor Fernández Almagro, 3. 28029 Madrid. España.

Correo electrónico: mtorres@cnic.es