Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio, y el protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética de investigación del centro. El estudio se atuvo a los principios de la Declaración de Helsinki.

Se incluyó a 40 pacientes con EA grave, en estadio D18, para los que se había programado reemplazo quirúrgico de la válvula aórtica. Todos los pacientes tenían un diagnóstico clínico previo de IC crónica basado en la presencia de como mínimo 1 criterio mayor de Framingham y 2 menores9. No se incluyó a los pacientes con angina o síncope pero sin signos de IC previa. Todos los pacientes habían tenido como mínimo 1 hospitalización previa por disnea de clase IV secundaria a IC. Todos los pacientes se encontraban en clases funcionales II-IV de la New York Heart Association y tenían una fracción de eyección del VI ≥ 55%. Se excluyó a los pacientes con una enfermedad coronaria significativa (estenosis ≥ 70% en alguna arteria coronaria epicárdica o ≥ 50% en el tronco coronario izquierdo), antecedentes de síndrome coronario agudo o de intervención de revascularización o enfermedad renal crónica en estadio 4-5. Se obtuvieron de cada paciente 2 biopsias transmurales de la pared libre del VI entre la arteria coronaria descendente izquierda y la circunfleja, mediante una aguja tru-cut durante la intervención de reemplazo de la válvula aórtica.

Se obtuvieron muestras cardiacas de 10 participantes emparejados por edad y sexo que habían fallecido por enfermedades no relacionadas con causas cardiovasculares, y se procesaron para el estudio histomorfológico, para utilizarlas como controles. Ninguno tenía antecedentes previos de enfermedad cardiovascular y la evaluación de los informes de autopsia determinó la ausencia de lesiones cardiacas macroscópicas y microscópicas.

Menos de 1 semana antes de la operación, 2 operadores experimentados llevaron a cabo estudios ecocardiográficos estándares de todos los pacientes con un ecógrafo digital iE33 (Philips). Se obtuvieron imágenes en la espiración, para tener en cuenta las ligeras variaciones del flujo sanguíneo durante la respiración. Las determinaciones se basaron en la media obtenida en 3 ciclos cardiacos (5 en caso de fibrilación auricular). No se observó valvulopatía mitral significativa ni insuficiencia aórtica en los pacientes. Treinta y cinco pacientes estaban en ritmo sinusal y 5, en fibrilación auricular. No se suspendió la medicación antes del estudio ecográfico. Las dimensiones del VI y la aurícula izquierda se midieron según las recomendaciones de la American Society of Echocardiography10. Se calculó la masa del VI con la fórmula de Devereux, y se indexó según el área de superficie corporal (índice de masa del VI). La hipertrofia ventricular izquierda se definió como un índice de masa del VI > 115 g/m2 en los varones y > 95 g/m2 en las mujeres10. Aplicando esta definición, todos los pacientes presentaban hipertrofia del VI. La fracción de eyección del VI se midió con el método de Simpson. La función diastólica se evaluó mediante el análisis de las velocidades máximas de flujo transmitral temprano (E) y tardío (A) en la diástole, el flujo venoso pulmonar, la velocidad de propagación del flujo mitral y los índices Doppler tisulares en la parte septal y lateral del anillo mitral. Se calculó el cociente E:e’, donde e’ es la velocidad diastólica inicial máxima del promedio de desplazamiento septal y lateral del anillo mitral. Se determinó la ausencia o presencia de presiones de llenado del VI elevadas según los valores del cociente E:e’ fueran ≤ 15 o > 15 respectivamente11. Se determinó en todos los pacientes los valores medio y máximo de gradiente de presión transvalvular, así como el área de la válvula aórtica.

Se obtuvieron de cada paciente 2 biopsias transmurales de la pared libre del VI entre la arteria descendente izquierda y la circunfleja, mediante una aguja tru-cut durante la intervención de reemplazo de la válvula aórtica, antes de que se iniciara la circulación extracorpórea. Una de las muestras se fijó de inmediato en formaldehído al 4% y se incluyó en parafina. De los últimos 20 pacientes, se congeló otra muestra a una temperatura de corte óptima para las posteriores determinaciones mediante microscopia de fuerza atómica. No se produjeron complicaciones durante ni después de la biopsia.

Se determinó la fracción aminoterminal del propéptido natriurético cerebral en muestras de plasma mediante ELISA (Roche Diagnostics).

Se determinó la fracción del volumen miocárdico ocupada por colágeno (FVC) con una morfometría cuantitativa realizada con un sistema de análisis automático de imágenes, en cortes teñidos con rojo picrosirio específico para el colágeno (rojo Sirius F3BA en ácido pícrico acuoso). Se excluyó del análisis el endocardio. Se definieron 2 localizaciones del depósito de colágeno: misial (bandas delgadas asociadas con grupos de células o perimisio y colágeno que rodean e interconectan células individuales o endomisio), y no misial (franjas grandes localizadas en los espacios intersticiales y perivasculares) (figura 1). Las determinaciones de la FVC de 2 pacientes se desecharon a causa de artefactos de imagen causados por una morfología anormal del tejido miocárdico procesado (grosor excesivo del endocardio y tejido subendocárdico anormalmente bajo) causantes de una tinción de rojo picrosirio aberrante (con porcentajes de FVC superiores al 50%). En los restantes 38 pacientes con determinaciones de la FVC válidas, se midieron la FVC total y no misial y se calculó la FVC misial restando la FVC no misial de la FVC total12. Se calculó el cociente FVC no misial:FVC misial de cada paciente.

Figura 1.

Tejido endomiocárdico procedente del paciente 1, que sufría EA grave con FEc y síntomas de IC. Los cortes se tiñeron con rojo picrosirio y las fibras de colágeno se identifican por el color rojo. Mientras que el colágeno misial se identifica como bandas delgadas alrededor de los miocardiocitos o grupos de miocardiocitos (estrellas), el colágeno no misial se identifica como franjas grandes de localización difusa en todo el intersticio (rectángulos) y alrededor de los vasos intramiocárdicos (óvalos). Aumentos, × 40. EA: estenosis de la válvula aórtica; FEc: fracción de eyección conservada; IC: insuficiencia cardiaca. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

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El análisis biomecánico se realizó en muestras miocárdicas de 20 pacientes de las mismas regiones misiales y no misiales utilizadas para la determinación de la FVC. Estos 20 pacientes corresponden a los últimos incorporados al estudio, una vez ampliamente comprobado el método de microscopia de fuerza atómica. Los cortes (de 14 μm) se aplicaron a cubreobjetos con carga positiva y se sometieron a un proceso de descelularización durante 10 min en dodecilsulfato de sodio al 1%, y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Esta incubación basta para descelularizar por completo los cortes de miocardio. Todas las determinaciones micromecánicas se realizaron con un microscopio de fuerza atómica NanoWizard III Atomic Force Microscopy (JPK; Berlín, Alemania) acoplado a un microscopio óptico invertido Zeiss Axio Observer (Zeiss; Oberkochen, Alemania). Las mediciones se realizaron con soportes volados sin punta, con una constante de elasticidad nominal (k) de 0,03 N/m (MLCT, Bruker; Mannheim, Alemania) y acoplado a microesferas de polistireno de 10 μm de diámetro. La constante de elasticidad real se calibró mediante calibrado térmico. A partir de la aproximación entre la punta y la muestra, se obtuvo una curva de fuerza frente a indentación que se ajustó luego al modelo de Hertz para puntas esféricas para un indentación de 500 nm13. Se realizaron 200 curvas de fuerza-penetración por muestra de paciente. Se obtuvo el módulo elástico de Young (YEM) efectivo, la deflexión del punto de contacto (doff) y la altura del punto de contacto (zc) a partir de la siguiente ecuación:

En cada uno de estos pacientes, se calculó la media de YEM de las 2 regiones no misiales evaluadas y se determinó el cociente YEM no misial:YEM misial.

La fracción de volumen del miocardio ocupada por las fibras de colágeno tipos I (FVCI) y III (FVCIII) se determinó mediante inmunofluorescencia y microscopia confocal en muestras de tejido obtenidas de 5 pacientes, específicamente en las 2 regiones misiales y 1 región no misial en las que se había determinado anteriormente el YEM. Se seleccionó a estos 5 pacientes de manera consecutiva, y se excluyeron solo los casos cuyas muestras de tejido parecían inapropiadas en la evaluación macroscópica.

Los cortes se tiñeron con anticuerpos monoclonales anticolágeno tipo I y tipo III (Abcam) (figura 2) y se cuantificó la fluorescencia. Se calculó el cociente FVCI:FVCIII con objeto de valorar los cambios relativos entre los 2 tipos de fibras de colágeno.

Figura 2.

Tejido endomiocárdico procedente del paciente 1, que sufría EA grave con FEc y síntomas de IC. Los cortes se tiñeron con anticuerpos monoclonales específicos dirigidos contra los colágenos de tipo I y III, y las fibras se identificaron en la microscopia confocal en verde y amarillo respectivamente. A: la región misial de la red de colágeno. B: la región no misial de la red de colágeno. Aumentos, × 60. EA: estenosis de la válvula aórtica; FEc: fracción de eyección conservada; IC: insuficiencia cardiaca.

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Los valores se expresan en forma de media ± desviación estándar, mediana [intervalo intercuartílico] o número de participantes (%). Se evaluó la distribución normal de todas las variables continuas mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Las diferencias entre los grupos se evaluaron con la prueba de la t de Student para datos no emparejados. Las variables con distribución no paramétrica se examinaron tras una transformación logarítmica. Para los datos con distribución no normal, se utilizó una prueba no paramétrica (prueba de la U de Mann-Whitney). Las correlaciones se estimaron con el coeficiente de correlación de Pearson y análisis de regresión univariable. Los cocientes de FVC no misial:misial y de YEM no misial:misial se multiplicaron para obtener una variable compuesta que reflejara tanto las propiedades anatómicas como las biomecánicas de la matriz de colágeno en las regiones no misiales respecto a las regiones misiales. La influencia de los factores de confusión en las correlaciones de interés, teniendo en cuenta las que se asociaban con el cociente E:e’ en el análisis de regresión univariable (presión arterial sistólica, glucosa en ayunas y área valvular indexada), así como el índice de masa del VI, la edad y el sexo, se excluyó mediante análisis de regresión lineal múltiple (con un mínimo de 10 participantes por cada variable en los modelos finales). No se consideraron otros ajustes adicionales, dado el bajo número de pacientes. La significación estadística se estableció en un valor bilateral de p = 0,05. Los análisis se llevaron a cabo con el programa STATA (versión 12.1).

La red de colágeno del miocardio se divide en un componente misial y otro no misial, que cumplen diversas funciones14. Concretamente, el componente no misial es la matriz de colágeno que se encuentra entre el endotelio del miocardio y el epicardio, y forma una matriz compleja de fibras de colágeno. La evidencia existente indica que el aumento de la red de colágeno no misial se asocia con alteraciones de la función diastólica15,16. En consonancia con esta posibilidad, se observó que, en los pacientes con EA grave, FEc y síntomas de IC, un exceso de colágeno no misial se asociaba con un aumento de las presiones de llenado del VI según lo indicado por el aumento del cociente E:e’. Es interesante que esta asociación no estuviera influida por la hipertrofia del VI, lo cual indica la importancia de la acumulación de colágeno no misial para las propiedades de elasticidad del VI con sobrecarga de presión17, un concepto ya propuesto anteriormente en estudios experimentales18–20.

Otra cuestión que se plantea es si las propiedades biomecánicas de la red de colágeno del miocardio y, por lo tanto, la matriz extracelular del miocardio se afectan por la diferente expresión de los fenotipos de fibras de colágeno. Un estudio realizado ex vivo en tejido de aurícula derecha humano demostró que, en comparación con las fibras de colágeno de tipo III, las de tipo I tenían un YEM significativamente superior21. Teniendo en cuenta las consecuencias funcionales de esta observación, se podría plantear la hipótesis de que un aumento relativo del colágeno de tipo I podría conferir más rigidez y peor función diastólica a la red de colágeno del miocardio. En consonancia, se observó que había una asociación entre el predominio de fibras de colágeno de tipo I, frente a las de tipo III, y el aumento de rigidez de la región no misial de la red de colágeno de los pacientes con EA grave, FEc y síntomas de IC. Esta observación podría aportar un vínculo para el mecanismo de acción de la asociación antes comentada entre el depósito de colágeno no misial y la disfunción diastólica del VI.

¿Cuáles son las consecuencias clínicas de las observaciones descritas? El seguimiento a largo plazo de pacientes con EA grave tras un reemplazo de la válvula aórtica indica que la sustitución valvular puede no proporcionar una reversión completa de los cambios inadaptados que se producen en la matriz extracelular miocárdica secundarios al estado de sobrecarga de presión. De hecho, las anomalías residuales de la matriz extracelular, como la fibrosis miocárdica, probablemente sean la causa de las anomalías persistentes de la función diastólica del VI y el aumento de la morbilidad y la mortalidad después del reemplazo de la válvula aórtica1. En consecuencia, se necesitan tratamientos novedosos que vayan más allá de la sustitución de la válvula aórtica de los pacientes con EA, es decir, aquellos con FEc y síntomas de IC. El desarrollo de nuevos tratamientos requiere la identificación de los mecanismos moleculares que conducen a la aparición de la disfunción diastólica en estos pacientes. En el presente estudio se identifica un mecanismo de este tipo como posible diana: la acumulación excesiva de colágeno de tipo I en las regiones no misiales de la red de colágeno del miocardio que da lugar a un aumento de la rigidez de la matriz extracelular. Además, se podría usar los biomarcadores circulantes o las exploraciones de imagen que reflejan estos cambios del colágeno tisular del miocardio para mejorar los criterios diagnósticos y también para la evaluación del pronóstico en la EA grave con FEc y síntomas de IC. A este respecto, es posible que, tal como se ha observado en los pacientes con cardiopatía hipertensiva e IC con FEc22, los cambios en la concentración sérica del inhibidor tisular de las metaloproteinasas de matriz 1 puedan ser útiles para detectar la más temprana aparición de disfunción diastólica del VI producida por el colágeno, así como para el seguimiento de la eficacia del reemplazo de la válvula aórtica para reparar el remodelado miocárdico en la EA grave con FEc y síntomas de IC.

Este estudio tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, el estudio contó con un número de pacientes relativamente bajo. Concretamente, la evaluación de los fenotipos del colágeno se realizó en un pequeño número de muestras de biopsia consecutivas, y no seleccionadas aleatoriamente. Sin embargo, dada la naturaleza de los objetivos de la investigación, tuvo la potencia estadística suficiente. Es importante tener en cuenta que no se observaron diferencias en la comparación de las características basales de los 40 pacientes iniciales, los 20 con determinación del YEM y los 5 con cuantificación de la FVCI y la FVCIII (datos no presentados). Segundo, además de por los cambios observados en el cociente entre los tipos de colágeno, la calidad del colágeno puede afectarse también por modificaciones postraslacionales de las moléculas de colágeno, en especial un aumento de los enlaces cruzados23. De hecho, se ha descrito que un exceso de enlaces cruzados del colágeno se asocia con un aumento de la rigidez miocárdica en los pacientes hipertensos con IC y FEc24,25. Lamentablemente, el pequeño número de biopsias obtenidas en este estudio no permitió realizar una evaluación del colágeno con y sin enlaces cruzados. Tercero, la rigidez del miocardio también está determinada por la proteína sarcomérica titina, que regula la tensión pasiva de los miocardiocitos26. Tal como se ha demostrado recientemente, el estado de fosforilación de la titina se asocia con un aumento de la rigidez miocárdica dependiente de la titina en los pacientes con IC y FEc hipertensos25 y en los diabéticos con estenosis aórtica27. Así pues, aunque la rigidez se evaluó en tejido descelularizado, serán necesarios nuevos estudios en tejido intacto para determinar la rigidez miocárdica dependiente de miocardiocitos en los pacientes con EA e IC con FEc. Cuarto, dado que son de carácter descriptivo, las asociaciones observadas entre los parámetros que valoran la FVC y el YEM y el cociente E:e’ no establecen una relación causal. Y quinto, la estimación de las presiones de llenado altas evaluando el cociente E:e’ plantea algunas limitaciones, en especial en casos de IC descompensada, disfunción grave del VI, ventrículos grandes, anomalías de la conducción o insuficiencia mitral importante. Sin embargo, en la población de este estudio no se daba ninguna de estas situaciones.