En el material adicional se presenta una lista detallada de reactivos.

Se indujo SC a 20 cerdas Yorkshire (37,8±5,2kg); la tasa de supervivencia fue del 90%. Al final de la intervención experimental, 10 animales recibieron ivabradina 0,3mg/kg y 10 recibieron placebo (solución salina); 2 animales (1 de cada grupo) no sobrevivieron más de 24 h después del SC.

Se anestesió a los cerdos, previamente tratados con ketamina intramuscular (10mg/kg) y midazolam (0,5mg/kg), mediante inhalación de isoflurano con perfusión continua de propofol (2ml/kg/h), fentanilo (50mg/kg/h) y diazepam (10mg/kg/h). Los animales fueron intubados y ventilados con una saturación de oxígeno del 100%. Además, los animales recibieron 5.000 UI de heparina y amiodarona (2mg/kg/h) para evitar la coagulación sanguínea en los catéteres y arritmias cardiacas malignas respectivamente.

Se indujo isquemia/reperfusión mediante la oclusión de la arteria descendente anterior izquierda durante 45min con un catéter JL 3 de 6 Fr e inflado de balón a 5 atm; se indujo sobrecarga de volumen administrando 500ml de hidroxietil-almidón y 1.500ml de suero salino al 0,9%. En los casos en que se produjo fibrilación ventricular/taquicardia ventricular, se administró una descarga de CC bifásica (10-20J) combinada con compresiones torácicas manuales directas. Las mediciones hemodinámicas se registraron a los 15, 30 y 45min de isquemia. Posteriormente, se administraron noradrenalina (20-80μg/kg/h), dobutamina (240-660μg/kg/h) y solución salina fisiológica (1.000-2.000ml) hasta que la frecuencia cardiaca superó los 90 lpm. A los 45min de oclusión de la arteria descendente anterior izquierda, se aleatorizó a los animales a un grupo de control o a otro con administración de ivabradina.

La ivabradina en polvo se pesó en una balanza de laboratorio de alta precisión y se diluyeron en agua destilada a un mínimo de 12mg/ml. A continuación, la solución se traspasó a una jeringuilla de 10ml para la administración intravenosa al animal de un bolo lento de 0,3ml/kg. El grupo de control recibió un volumen equivalente de solución salina fisiológica.

La extensión del infarto de miocardio se evaluó mediante perfusión con el reactivo azul de Evans al 5% (en suero) y tinción de trifenil tetrazolio (TTC) como se ha descrito con anterioridad12 (para obtener más detalles, consulte el material adicional).

La troponina I plasmática se midió con el kit comercial Human Cardiac Troponin 1 SimpleStep ELISA (Abcam, España) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los corazones de cerdo se visualizaron mediante el ecocardiógrafo Vivid Q de GE Healthcare (Estados Unidos) equipado con un cabezal de exploración de 1,9 a 4,0 MHz, como se ha descrito con anterioridad13. Se ofrece más información en el material adicional.

Las células H9c2 y HL1B se cultivaron como se ha descrito con anterioridad14 y en el material adicional. Las células se cultivaron en condiciones de hipoxia en cámaras de cultivo de hipoxia en atmósfera humidificada con un 1% de oxígeno, un 5% de dióxido de carbono y un 94% de nitrógeno. La reoxigenación se realizó en medio fresco.

Las técnicas de histológica, inmunohistoquímica e inmunohistofluorescencia se realizaron como se ha descrito con anterioridad13,14.

El aislamiento de los lisados de proteínas, las inmunoprecipitaciones y las inmunotransferencias se realizaron como se ha descrito con anterioridad13.

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) se realizó como se ha descrito con anterioridad8. En el material adicional se ofrece más información. Se utilizaron los siguientes cebadores: EMMPRIN directo: 5’-GGC ACC ATC GTA ACC TCT GT-3’; EMMPRIN inverso: 5’-CAC TGG CGT GTT CCG ATT TC-3’; β-actina directa: 5’-CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CT-3’, y β-actina inversa: 5’-CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TT-3’.

Todos los datos se analizaron con el paquete estadístico SPSS 22.0 (SPSS Inc., Estados Unidos). Todos los valores se presentan como media±desviación estándar. La significación se informa al nivel del 5%. Siempre que se establecieron comparaciones con un control común, la significación de las diferencias se probó mediante análisis de varianza seguido de la modificación de Dunnett de la prueba de la t de Student.

En cerdos sometidos a SC (figura 1A), la administración intravenosa de ivabradina 0,3mg/kg o solución salina se asoció con una reducción considerable de la frecuencia cardiaca (figura 1B), conservación del volumen sistólico (figura 1C) y reducción de las concentraciones de troponina cardiaca, indicativas de lesión isquémica, 24 h después del SC (figura 1D). Los efectos de la ivabradina en la función cardiaca se determinaron mediante ecocardiografía, que reveló una mejora importante de la FEVI el séptimo día después del SC en animales tratados con ivabradina (figura 1E). Esta mejora se correlacionó estrechamente con una disminución del área necrótica del ventrículo izquierdo, detectado mediante la doble tinción con azul de Evans/TTC (figura 1F).

Figura 1.

La ivabradina mejora la función cardiaca en un modelo porcino de SC. A: representación esquemática del ensayo. B y C: efectos de ivabradina 0,3mg/kg o placebo en la frecuencia cardiaca y el volumen sistólico después del SC. D: concentraciones de troponina cardiaca antes y a las 24 h del SC (n=9 por grupo; media±desviación estándar; *ivabradina frente a placebo, p < 0,05). E: fracción de eyección del ventrículo izquierdo (N=9/grupo) a los 7 días del SC. F: área necrótica (n=5 por grupo) como porcentaje de tejido necrótico (pálido) frente al área en riesgo (rojo) a los 7 días del SC (media±desviación estándar; *ivabradina frente a placebo, p <0,05). SC: shock cardiogénico. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(0,57MB).

La isquemia/reperfusión coronaria induce la expresión de enzimas de degradación de la MEC cardiaca, incluidas las metaloproteinasas de la matriz (MMP). La administración de ivabradina 0,3mg/kg redujo las concentraciones de MMP-9 en el área necrótica del ventrículo izquierdo el séptimo día después del SC, según lo detectado por inmunohistoquímica e inmunotransferencia con anticuerpos anti-MMP-9 (figura 2A,B respectivamente).

Figura 2.

La ivabradina reduce la concentración de enzimas que degradan la matriz extracelular en el corazón. A: detección de MMP-9 en las áreas necróticas de corazones sometidos a SC en respuesta a placebo o ivabradina (n=5 por grupo; media±desviación estándar; *necrosis e ivabradina frente a necrosis y placebo, p < 0,05). B: inmunoblot de pro-MMP-9 de 92 kDa de secciones sanas (S), en riesgo (R) y necróticas (N) de corazones sometidos a SC (n=5 por grupo; media±desviación estándar; *necrosis e ivabradina frente a necrosis y placebo, p < 0,05). MMP-9: metaloproteinasa 9 de matriz; SC: shock cardiogénico. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(0,4MB).

El papel de EMMPRIN como inductor de la expresión y actividad de MMP-9 se ha descrito con anterioridad3, aunque en nuestro modelo porcino la expresión inducida por SC del ARNm de EMMPRIN no se inhibió con la administración de ivabradina 0,3mg/kg (figura 3A). Sin embargo, en respuesta al SC, la ivabradina fue capaz de reducir tanto la concentración de EMMPRIN como su glucosilación, sin afectar a su degradación proteolítica, como se observa tras la incubación de lisados celulares de miocitos H9c2 con el inhibidor del proteosoma MG-132 (figura 3B). Además, la incubación de células H9c2 en reposo con ivabradina no inhibió la glucosilación de EMMPRIN (un paso clave en la expresión y la actividad de las MMP mediada por EMMPRIN), como se observó con el tratamiento de células durante 24 h con tunicamicina 5 μg/ml, un inhibidor farmacológico de la N-glucosilación (figura 3C), y se obtuvieron resultados semejantes en cultivos celulares de miocitos HL1B (figura 1 del material adicional). En cambio, in vivo y en respuesta al SC, en comparación con los cerdos sometidos a SC y tratados con placebo, la ivabradina redujo considerablemente las formas de EMMPRIN muy glucosiladas (HG-EMMPRIN), lo que originó la acumulación de formas de EMMPRIN poco glucosiladas (LG-EMMPRIN) mediante mecanismos aún desconocidos (figura 3D).

Figura 3.

La ivabradina reduce la concentración de enzimas que degradan la matriz extracelular en el corazón. A: expresión por RT-PCR del ARNm de EMMPRIN en corazones de cerdos tratados con ivabradina 0,3mg/kg. Se utilizó GAPDH como control (n=3 por grupo; media±desviación estándar). B: immunoblot de EMMPRIN en células cardiacas H9c2 incubadas con MG-132. C: immunoblot de EMMPRIN en células cardiacas H9c2 incubadas con tunicamicina; la flecha indica la localización de EMMPRIN no glucosilada nativa de bajo peso molecular de 20 kDa. D: expresión de EMMPRIN en áreas necróticas de corazones sometidos a SC e incubados con ivabradina (n=3 por grupo; media±desviación estándar; *HG-EMMPRIN frente a LG-EMMPRIN con SC+ivabradina, p < 0,05). Se utilizó betatubulina como control (B-D). Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(0,27MB).

Las caveolas son vesículas enriquecidas con esfingolípidos y colesterol donde se localizan muchas vías de señalización que desempeñan funciones clave en la supervivencia, la muerte, la proliferación o la migración celulares. En el corazón, el componente principal de las caveolas es la caveolina-3, que ejerce funciones cardioprotectoras al unirse a varias proteínas. Previamente se demostró que el óxido nítrico induce cardioprotección al estabilizar el complejo caveolina-3/LG-EMMPRIN y, por lo tanto, prevenir la necrosis cardiaca inducida por MMP dependiente de HG-EMMPRIN14. En este caso, se ha detectado una fuerte colocalización entre caveolina-3 y EMMPRIN en respuesta a ivabradina 0,3mg/kg (figura 4A, panel combinado de ivabradina, amarillo); los análisis de coinmunoprecipitación revelaron un aumento de LG-EMMPRIN unido a caveolina-3 (figura 4B) en respuesta a ivabradina, lo que indica que la ivabradina puede reducir la degradación de la MEC inducida por SC al conservar el complejo caveolina-3/LG-EMMPRIN.

Figura 4.

La ivabradina previene el desacoplamiento del complejo EMMPRIN/caveolina-3 en cerdos sometidos a shock cardiogénico. A: detección por microscopia confocal de caveolina-3 (Cy3, rojo) y EMMPRIN (FITC, verde) en secciones de corazón de cerdos tratados con ivabradina o placebo (colocalización en paneles combinados en amarillo) (n=3 por grupo; media±desviación estándar; *ivabradina frente a placebo, p <0,002). B: immunoblot de caveolina-3 y EMMPRIN en extractos inmunoprecipitados de caveolina-3 (n=3 por grupo; media±desviación estándar; *SC frente a IVA SC, p < 0,05). Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(0,54MB).

Además de EMMPRIN, la caveolina-3 también se une a HCN415, diana principal de la ivabradina. La observación de caveolina-3 mediante microscopio confocal en secciones del ventrículo de corazones sanos permitió detectar un complejo proteico que incluye caveolina-3, EMMPRIN y HCN4 (figura 5A), aunque los más interesante es que se detectó que tras el SC, los complejos caveolina-3/EMMPRIN y caveolina-3/HCN4 aumentaron en presencia de ivabradina frente a placebo (figura 5B). Este resultado indica que la caveolina-3 puede ser un objetivo de la ivabradina en la cardioprotección, por una parte, al prevenir la degradación de la MEC mediante el aumento de la unión a EMMPRIN y, por la otra, al estabilizar el complejo con HCN4 y reducir la frecuencia cardiaca, como se ha observado anteriormente (figura 1). Además, por vez primera se ha desvelado el complejo proteico existente entre HCN4 y EMMPRIN y la capacidad de la ivabradina para su desacoplamiento.

Figura 5.

La ivabradina regula la unión de caveolina-3, HCN4 y EMMPRIN. A: detección por microscopia confocal de caveolina-3 (FITC [verde]), HCN4 (TRITC 561 [rojo]) y EMMPRIN (Alexa Fluor 350 [azul]) en secciones de corazón de cerdos sanos. B: a los 7 días del SC en cerdos tratados con ivabradina 0,3mg/kg o placebo (n=3 por grupo; media±desviación estándar; *HCN4/CAV3 placebo frente a ivabradina, p <0,05; #HCN4/EMMPRIN placebo frente a ivabradina, p < 0,002; @HCN4/EMMPRIN placebo frente a ivabradina, p <0,05). FITC: isotiocianato de fluoresceína; TRITC: isotiocianato de tetrametilrodamina; SC: shock cardiogénico. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(1,3MB).

Con el objetivo de demostrar si la caveolina-3 puede servir como punto de acoplamiento entre HCN4 y EMMPRIN, se silenció la expresión de caveolina-3 con ARN de interferencia (siRNA) específicos en células cardiacas H9c2, utilizando la concentración de 10nM de siRNA por reducir la expresión de caveolina-3 en más del 75% frente a células no transfectadas o células transfectadas con una forma de siARN utilizada como control negativo (figura 6A). Se pudo confirmar que la HCN4 se unió a EMMPRIN tanto en células que expresan caveolina-3 como en células silenciadas, lo que indica que hay una interacción directa entre ambas proteínas (figura 6B), mientras que en presencia de ivabradina se produjo un desacoplamiento significativo, independientemente de la expresión de caveolina-3 (figura 6B). Asimismo, el silenciamiento de la caveolina-3 supuso la sobrexpresión de la MMP-9, que se inhibió en presencia de ivabradina (figura 6C), lo que indica que la ivabradina influye en la acción de la caveolina-3 preventiva de la degradación de la MEC.

Figura 6.

La falta de caveolina-3 altera la formación del complejo EMMPRIN/HCN4. A: inmunoblot de caveolina-3 de células H9c2 transfectadas con lipofectamina (sin ARNip) o ARNip1 de caveolina-3 1, 10 y 25nM. Se utilizó tubulina beta como control negativo. B: panel superior, immunoblot de HCN4 de extractos inmunoprecipitados con HCN4 de células H9c2 silenciadas con siARNi de caveolina-3 10nM; panel inferior, immunoblot de EMMPRIN de los mismos extractos (n=3). C: immunoblot de MMP-9 en células silenciadas con H9c2 incubadas con ivabradina 0,3mg/kg (n=3; media±desviación estándar; *ARNip frente a ARNip + ivabradina, p <0,001). MMP-9: metaloproteinasa de la matriz extracelular 9; siARN: ARN de interferencia. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(0,2MB).

De la misma manera, para investigar el papel de EMMPRIN en el complejo entre caveolina-3 y HCN4, se silenció la EMMPRIN mediante ARN de interferencia específicos (figura 7A), gracias a lo cual se pudo reducir las concentraciones del complejo HCN4/caveolina-3, detectado mediante inmunotransferencia de HCN4 en lisados celulares de H9c2 inmunoprecipitadas con caveolina-3 (figura 7B, carril 3). Este resultado indica que se requiere EMMPRIN para mantener el complejo HCN4/caveolina-3 y que su interacción se restaura parcialmente mediante la incubación con ivabradina (figura 7B, carril 4), lo que señala que la unión entre caveolina-3 y HCN4 independiente de EMMPRIN se produce en respuesta a la ivabradina.

Figura 7.

La falta de EMMPRIN altera la formación del complejo caveolina-3/HCN4. A: silenciamiento génico de EMMPRIN con siARN específico de EMMPRIN; Se empleó tubulina beta como control de carga. B: inmunoblot de HCN4 de extractos inmunoprecipitados con anticaveolina-3 de células H9c2 silenciadas con siARN de EMMPRIN 10nM (n=3; media±desviación estándar; *siARN de HCN4 frente a siARN + ivabradina, p <0,004). siARN: ARN de interferencia. Esta figura se muestra a todo color solo en la versión electrónica del artículo.

(0,18MB).

Una de las limitaciones del estudio es haber empleado hembras, pues machos y hembras tienen diferentes fisiologías cardioprotectoras32, lo que puede comprometer el grado de lesión cardiaca e insuficiencia cardiaca relacionadas con el evento isquémico. El uso de cultivos de células H9c2 de rata también es una limitación, ya que el aislamiento de cardiomiocitos de cerdo sería el mejor enfoque experimental para probar los parámetros específicos abordados en este trabajo. Sin embargo, el aislamiento de cardiomiocitos porcinos entraña una complicación significativa, lo que llevó a utilizar células H9c2 y HL1B para evaluar la hipoxia y la reoxigenación.